Биологическая война (Часть 3) - [16]

по наличию в бактериальной клетке нехарактерных для нее генетических структур или генов. Методический уровень использованных для этого способов исследования будет зависеть от технологий, с помощью которых новая генетическая информация была введена реципиенту. Бациллярные клонирующие векторы первого поколения, использованные в 1980-х гг. для конструирования генетически измененных штаммов сибиреязвенного микроба, представляли собой многокопийные автономно реплицирующиеся молекулы ДНК, не способные интегрироваться с геномом бактерии-реципиента. Независимо от способа генетического переноса обнаружить «лишнюю» плазмиду среди собственных плазмид реципиента можно по плазмидному профилю (рис. 3.8).

_{Рис 3.8. Переданная посредством фаговой трансдукции чужеродная плазмида у В. anthracis и в других бациллах, Широкая диффузная полоса соответствует фрагментам хромосомной ДНК. А. В. cereus GР7. В. В. anthracis Weybiidge A UM18. С. В. armtraas Weybridge A UM18(pBC16), D. В. thuringiensis 40428 UM45 Е. В. thuringiensis 40428 UM45(pBC16). F. В. thuringiensis 406 °C UM473. G. В. thuringiensis 406UC UM473(pECl6). H. B. thuringiensis YGA UM1.1. B. thuringiensis YGA UMl(pBC16). J. B. cereus 5°9 UM47. К. B. cereus 569 UM47(pBC16). Перенос плазмиды pBC16 (2,b мДа, Тс^r) осуществлен бактериофагом СР-51. Фенотипически наличие у реципиентного штамма плазмиды рВC16 проявляется устойчивостью к тетрациклину/ По R. Е. Ruhfel et al. (1984)}

На электрофореграммах ДНК разделенной в агарозном геле (см. рис. 2.3 и 3.8), «лишняя» плазмида обнаруживается в виде фракции, дополнительной к собственным плазмидам (для рВС16 — фракция, по подвижности соответствующая ММ 2,8 мДа). Далее «лишнюю» плазмиду можно выделить из агарозного геля (вырезав соответствующий кусочек из геля), перетрансформировать в более удобную для генетических исследований бациллу, чем В. anthracis[4], получить в препаративных количествах и установить ее происхождение путем молекулярного сравнения с известными плазмидами, имеющими то же предназначение.

Появившиеся в начале 1990-х гг. интегративные векторы позволяют вставить чужеродный ген непосредственно в хромосому бактерии (см. разд. 2.2.2 «Технологии рекомбинантной ДНК в получении штаммов бактерий с неправильной эпидемиологией»). Пример получения штаммов сибиреязвенного микроба с интегрировавшимися в их хромосому генами сфингомиелиназы и фосфолипазы приводят Л. И. Маринин с соавт. (1999). По их данным, В. anthracis Ч-7(рОВ12) вызывал сибиреязвенную инфекцию у лабораторных животных, иммунизированных вакциной на основе штамма СТИ-1. Однако ни методы электрофоретического разделения ДНК, ни хорошо зарекомендовавшие себя для обнаружения инфекционных агентов диагностические тесты, основанные на амплификации ДНК (ПЦР в любых вариантах исполнения), не могут быть использованы для обнаружения генетически модифицированных патогенов, если новая генетическая информация «добавлена» в их хромосому. Основной недостаток таких способов состоит в том, что они требуют предварительного и досконального знания специфических генетических вариантов микроорганизма, изучаемого на предмет генетической модификации. В последние годы эту задачу пытаются решить на принципиально более высоком уровне — используя новые платформы секвенирования и, в частности, пиросеквенирование. Способ позволяет установить разнообразные типы генетических изменений в геноме — инсерции и делеции, единичные нуклеотидные полиморфизмы, единичные тандемные повторы и вариабельные участки генов, Chen P. Е. et al. (2010) исследовали возможности способа для выявления генетически измененных штаммов В. anthracis Ames Ancestor[5] и Sterne. В частности, по результатам пиросеквенирования ими в геноме штаммов сибиреязвенного микроба выявлены вставки генной кассеты с геном резистентности к эритромицину; мутации, предопределяющие низкоуровневую и высокоуровневую резистентность В. anthracis к ципрофлоксацину; идентифицированы мутации, приводящие к спонтанной резистентности к фагу и др. изменения. Эти исследования поставили некую планку, ниже которой в ближайшем десятилетии исследования по идентификации генетически измененных агентов ВО опускаться не будут.

Патогенез. В клинике сибирской язвы преобладают две группы симптомов:

1) обусловленные способностью В. anthracis к генерализации в клетках лимфоидной системы с последующим развитием септической формы болезни.

2) проявления местного патологического процесса, обусловленного действием экзотоксина В. anthracis (повышение проницаемости капилляров, нарушения микроциркуляции, отек тканей и коагуляционный некроз) в первичном фокусе инфекции;

На месте внедрения возбудителя в кожу развивается сибиреязвенный карбункул (реже — эдематозная, буллезная и эризипелоидная формы поражения кожи) в виде очага серозно-геморрагического воспаления с некрозом, отеком прилегающих тканей, регионарным лимфаденитом. Развитие лимфаденита обусловлено заносом возбудителя подвижными макрофагами из места внедрения в ближайшие регионарные лимфатические узлы. Дальнейшая генерализация В. anthracis