С первых же часов войны группы "охотников" использовались для эскортирования бомбардировщиков. Подразделения I(Z)/LG 1 были задействованы для прикрытия бомбардировочных групп в налете на Варшаву, a I/ZG 76 прикрывали I и III/ KG 4 в налете на Краков. Они также использовались в поддержке налетов на Познань и на других участках фронта. Первое их столкновение с истребителями PZL Р.11 польских ВВС состоялось после полудня, когда Bf П0С-1 из I(Z)/LG 1 прикрывали Не 111Р из KG 27. Bf 110 спикировали на поднимавшиеся на перехват Р.П, которые, используя преимущество в маневре, ушли из под удара. Но в последующей общей "свалке" Bf 110С-1 сбили пять Р.И, не понеся потерь. Бой Bf 110С-1 из 1. и 2./ZG 76 над Ло-зью оказался не таким успешным: при уничтожении двух Р.П были потеряны три Bf 110. Но 3 сентября во время второго налета на Варшаву истребители I(Z)/LG 1 сбили пять Р.П, потеряв один Bf П0С-1. Вообще только группа I/ZG 76 претендовала на 30 сбитых в польской кампании самолетов. Правда, оценки польской стороны позволяют заключить, что на все Bf 110 реально приходилось 15-20 сбитых польских самолетов. По мере ослабления противодействия польских истребителей Bf 110 все больше переключались на удары .по наземным целям, а общие потери за польскую кампанию с 1 по 28 сентября 1939 г составили только 12 самолетов, два из которых были сбиты по ошибке собственной зенитной артиллерией.
Штаб люфтваффе посчитал, что "охотник" полностью оправдал себя в польской кампании. Недостатки "охотника" в бою истребитель против истребителя, которых так опасались, оказались не столь страшными, правда, основной боевой противник имел самолеты устаревшего типа. Наступательное вооружение "охотника" оказалось чрезвычайно эффективным, но это преимущество было трудно реализовать в воздушном бою против более вертких одномоторных истребителей.
Если воздушный бой с более маневренным одномоторным истребителем вызывал сомнения, то способность Bf 110 успешно вести перехват бомбардировщиков была эффективно продемонстрирована 18 декабря 1939 г. Днем ранее Bf 110С-1 из I/ZG 76 были переведены из Боннингхардта в Йевер для усиления так называемой эскадры "Шумахера", прикрывавшей район Ге-лиголанд Бигхт. Когда английские "Веллингтоны" из 9-го, 37-го и 149-го эскадронов пытались осуществить вооруженную разведку Шиллиг-Роад, устья Яде и Вильгельмсгафе-на, их перехватили Bf 110. Результат оказался для англичан обескураживающим. Из 24 "Веллингтонов" были потеряны 12, и девять из них можно отнести на счет Bf 110С-1 из 1. и 2./ZG 76. Сами "охотники" заявили о 14 победах - довольно "скромное" для немецких асов завышение потерь противника!
К началу 1940 г производство Bf 110С-1 резко увеличилось (месячный выпуск достиг 102-103 самолетов), соответственно увеличились и силы групп "охотников". I и II группы ZG 26 были полностью перевооружены. Весной-летом в строй вошла I1/ZG 76, были вооружены I и II/ ZG 2 и сформирована III группа ZG 26. В составе "инструкторской" эскадры была сформирована вторая группа "охотников" - V(Z)/LG 1.
Тогда же, в начале 1940 г. состоялись первые "экспортные" поставки Bf 110 за рубеж - в Советский Союз. Заключенное в конце 1939 г. торговое соглашение между Германией и Советским Союзом позволило советской закупочной комиссии в марте 1940 г. выбрать в числе образцов немецкого вооружения и пять Bf 110С.-
Мессершмитт Bf HOC в НИИ ВВС (на нижней поверхности крыла самолета виден код гражданской регистрации - D-FOXO).
Вид на центроплан Bf 110 (НИИ ВВС)
Двухмоторный "мессер" интенсивно испытывался в НИИ ВВС и получил высокую оценку. По скорости он превосходил состоящие на тот момент на вооружении советских ВВС истребители И-16 и И-153, но уступал новым истребителям И-26 (Як-1), И-200 (МиГ-1) и И-301 (ЛаГГ-1), которые, правда, еще предстояло запустить в серию. Максимальная скорость на высоте 5000 м составила 525 км/ч, что совпадало с фирменными данными, но у земли намерили только 442 км/ч - заметно меньше, чем заявленные 470 км/ч (возможно, что последняя цифра получена за счет использования одноминутного чрезвычайного взлетного режима работы двигателя у земли, в то время когда в НИИ ВВС летные данные замерялись на номинальном режиме работы двигателя). Зато скороподъемность (наборы высоты 5000 м за 8,4 мин.) и маневренность (полный вираж за 30 сек.) "мессера" не позволяли ему эффективно вести бой с современными истребителями. Вооружение самолета производило впечатление - масса секундного залпа в 2,85 кг/с делала его одним из самых мощных истребителей в мире. Отмечалась хорошая управляемость самолета, устойчивость, возможность полета на одном моторе. В целом испытания двухмоторного истребителя Мессершмитта подтолкнули советских конструкторов на работы в этом направлении, но довести до начала войны до серии ни один из проектов советского "охотника" так и не удалось… Сами же Bf 110 использовались в Советском Союзе для различных испытаний. Например, на одном из них проходила летные испытания 23-мм пушка Таубина МП-6. Один Bf 110С был передан в начале 1941 г в состав 158-го истребительного авиаполка ПВО.