Неандерталец. В поисках исчезнувших геномов - [43]

Вдохновленный результатом, Алекс придумал праймеры для амплификации двух коротких участков фрагмента особого гена, который носит название “ген фактора Виллебранда”; в геноме слона содержится только по одному такому гену. Фактор Виллебранда — его ген записывают как vWF — это белок крови, который помогает тромбоцитам прикрепляться к поврежденным кровеносным сосудам. Мы выбрали именно этот ген, так как его нуклеотидная последовательность как у слонов, так и у многих других млекопитающих уже была известна, и нам оставалось только выделить его из тканей мамонта и сравнить с уже имеющимися, современными. Я глазам не поверил, когда на очередном еженедельном лабораторном обсуждении Алекс показал картинки с полосками в геле, и это было не что иное, как амплифицированные фрагменты гена мамонта. Он повторил эксперимент дважды, каждый раз с заново приготовленными экстрактами из мамонтовой кости. Среди множества клонов, которые он секвенировал, были хорошо видны ошибки в отдельных молекулах ДНК, появляющиеся или из-за химического разрушения древних ДНК, или из-за пристраивания неправильного нуклеотида к цепочке ДНК при ПЦР (рис. 9.1). Но для одной из позиций Алекс заметил интересную закономерность. Он секвенировал в общей сложности тридцать клонов, проведя для каждого три независимые серии ПЦР. В одной из позиций у пятнадцати клонов стояло Ц, у четырнадцати — Т и у одного А. Единственный случай с аденином (А) мы посчитали ошибкой ДНК-полимеризации, но остальная картинка — у меня сердце замерло… Это конкретное место в цепочке являлось тем, что генетики называют гетерозиготной позицией, или, иначе, точечным нуклеотидным полиморфизмом (сокращенно — SNP, СНИП). В этом месте две копии данного гена, полученные от мамы-мамонтихи и папы-мамонта, различались. И нам удалось увидеть самую первую гетерозиготную позицию, СНИП, ледникового периода. То есть мы имели дело с генетикой в чистом виде, с генетикой в действии, если хотите, — вот вам ядерный ген, у которого в популяции встречается два варианта. Дело пошло на лад. Если нам удалось прочитать оба варианта этого гена, тогда, в принципе, остальные части генома тоже могут быть доступны. И таким образом, откроется возможность, по крайней мере теоретически, получать генетическую информацию о видах, вымерших много тысяч лет назад.

^{Рис. 9.1. Клонированные ДНК последовательности по трем амплификациям фрагмента ядерного гена мамонта возрастом 14 тысяч лет. Стрелка показывает на гетерозиготную позицию, или СНИП, впервые обнаруженную для ДНК из позднего плейстоцена. Из: A.D. Greenwood et al. Nuclear DNA sequences from late Pleistocene megafauna. Molecular Biology and Evolution 16, 1466–1473 (1999)}

Чтобы закрепить успех, Алекс отсеквенировал еще два фрагмента генов, имеющих по одной копии в ядре. Один из них кодировал белок, регулирующий выделение нейромедиаторов в мозге, а другой — белок, связывающий витамин А; этот последний вырабатывался палочками и колбочками в глазу. И в обоих случаях у Алекса все превосходно получилось.

Мы так долго бились с ядерной ДНК, что Алексовы результаты с мамонтом были встречены с величайшей радостью, и у меня несколько дней царил прямо праздник на душе. Но… не мамонты интересовали меня, совсем не мамонты. Неандертальцы — вот моя цель, а я точно знал, что в вечной мерзлоте неандертальцев не бывает. Я убедил Алекса вернуться к пещерным медведям и попробовать еще раз материал из Виндии: проверить, не сможем ли мы все же получить ядерную ДНК из остатков, не подвергшихся заморозке. Он проанализировал мтДНК нескольких пещерных медведей и выбрал кость, в которой, по всей видимости, ДНК содержалось больше всего. Мы сделали ее углеродный анализ — оказалось, 33 тысяч лет, что приблизительно соответствовало возрасту неандертальцев. Алекс стал работать именно с этой костью. Он попробовал выделить гены рибосомальной РНК — а в геноме множество их копий. И действительно, после амплификации Алексу удалось получить небольшое их количество. Далее он реконструировал последовательность из амплифицированных клонов. И выяснил, что у пещерных медведей она идентична соответствующим нуклеотидным последовательностям современных медведей.

Безусловно, это был успех, но с “ложкой дегтя”. Мы затратили столько усилий на ген с множеством копий в геноме; а что, если речь пойдет о гене, у которого есть только одна копия, например о vWF, с которым Алекс работал на мамонтовом материале? Тогда эксперименты заведомо обречены на провал. Алекс тем не менее попробовал и, как и ожидалось, потерпел неудачу. В глубине души — я никому об этом не рассказывал — я глубоко огорчился результатами экспериментов. Мы показали, что ядерная ДНК способна выдержать более десятка тысяч лет в вечной мерзлоте и что только следы даже самой распространенной ядерной нуклеотидной последовательности обнаруживаются в костях пещерных медведей. Разница между замораживанием и хранением в известняковой пещере была огромной.

В 1999 году мы опубликовали все открытия Алекса в прекрасной, на мой взгляд, работе^[42], которую незаслуженно обошли вниманием. Там доказывалось, что ядерная ДНК сохраняется в остатках из вечной мерзлоты и что в ней даже можно выявить гетерозиготную позицию, такую, где две хромосомные копии несут разные варианты нуклеотидных последовательностей. Мы с уверенностью говорили о перспективах генетических исследований остатков из вечной мерзлоты и в конце работы написали: “В отложениях вечной мерзлоты и в других холодных средах находится множество животных остатков. В подобных остатках выявляются не только мтДНК, но и ядерные ДНК-последовательности, причем во многих случаях представленные в геноме единственной копией; это открывает перспективы использования ядерных локусов в филогенетических и популяционных генетических задачах, а также в исследованиях генов, определяющих фенотипические признаки”.