Неандерталец. В поисках исчезнувших геномов - [42]

Проблема решалась очевидным способом: увеличить количество костного материала. Алекс сделал экстракты из большего количества кости и попробовал амплифицировать более короткие участки ядерных ДНК. Он использовал такие праймеры, которые подсоединялись к концам исключительно медвежьих ДНК-фрагментов, но наверняка не человеческих. Это для того, чтобы не тратиться лишний раз на человеческие ДНК-загрязнения. В этот раз Алекс не получил ничего, вообще ничего. Из этого мегаэкстракта не удалось амплифицировать даже митохондриальной ДНК. Ничего.

После нескольких недель бесплодных попыток и опытов с различными костями мы наконец догадались, что из большого количества ткани просто невозможно экстрагировать ДНК. И не потому, что амплифицировать там нечего, а потому, что экстракты содержали какое-то вещество, угнетающее ферменты, участвующие в ПЦР; ПЦР останавливалась, и на выходе оказывалось пусто. Мы промучились некоторое время, пытаясь определить и убрать непонятный ингибитор, но не смогли. Мы стали постепенно, поэтапно разбавлять экстракт, пока амплификация мтДНК снова не активировалась. Определив разбавленный до нужной концентрации раствор, мы пробовали амплифицировать ядерную ДНК. И получали… неудачу за неудачей. Я старался сохранять оптимизм, но шли месяцы, и Алекс все больше падал духом и волновался: будут ли вообще хоть сколько-нибудь годные для публикации результаты?.. Мы обдумывали и такую возможность: после смерти животного ядерные ДНК разрушаются ферментами, проникающими сквозь ядерную мембрану разлагающейся клетки. Митохондриальная же ДНК окружена двойной мембраной, потому лучше защищена от ферментных атак. Следовательно, у нее больше шансов дождаться, пока органическая ткань высохнет, замерзнет или окажется так или иначе недоступна для ферментов, и, таким образом, она может сохраниться. Такой сценарий заставил меня задуматься, а возможно ли в принципе обнаружить древнюю ядерную ДНК, даже если мы сумеем справиться с проблемой ингибитора ПЦР. Мало-помалу я, как и Алекс, впал в уныние. Итак, пещерные медведи нас подвели. Мы предположили, что, быть может, условия, в которых находились кости, просто не благоприятствовали сохранению ядерной ДНК. И мы приняли решение переключиться на другой материал, самой лучшей, как мы ожидали, сохранности: остатки мамонтов из вечной мерзлоты в Сибири и Аляске. Те мамонты замерзли сразу после смерти, а замораживание, как мы знаем, замедляет или совсем прекращает развитие бактерий и множество других химических реакций, включающих и разрушительные для ДНК. Мы уже знали из работ Матиаса Хёсса, что мамонты из Сибири дают большое количество мтДНК. Правда, неандертальцев никогда не находили в вечной мерзлоте, так что работа с мамонтами означала шаг в сторону от моей конечной цели. Но нам нужно было как-то узнать, способна ли в принципе ядерная ДНК пережить 10 или даже 100 тысяч лет. Если мы не найдем ядерные нуклеотиды в замороженных тканях мамонта, то всё, можно прекращать поиски: неандертальцев находят в куда менее благоприятных для сохранения условиях, и ядерная ДНК там уж и подавно не сохранится.

К счастью, я систематически коллекционировал древние кости из разных музеев, так что Алекс смог немедленно опробовать наши идеи на имеющемся материале. Он отобрал зуб мамонта, в котором осталось особенно много мтДНК. Этот зуб выкопали из вечной мерзлоты, когда строили главное шоссе на Аляске, идущее от северо-востока Британской Колумбии до Фэрбенкса. Шоссе строили в страшной спешке во время Второй мировой войны. Зуб нашли, положили в большую коробку и оставили ее в Американском музее естественной истории, там он с тех пор и лежал. Чтобы облегчить работу по выделению ДНК, мы наметили сегмент ядерного генома, содержащего часть гена, известного как 28S рДНК; он кодирует одну из молекул РНК рибосом, органелл, управляющих синтезом белков в клетке. Преимущество этого гена нам виделось в том, что в одной клетке содержалось несколько сотен его реплик. И получалось, что после смерти животного подобных фрагментов оставалось примерно столько же, сколько и мтДНК. К моему великому облегчению и радости, у Алекса получилось амплифицировать этот рибосомальный ген. Он секвенировал размноженные копии из вытяжки мамонта и реконструировал нуклеотидную последовательность этого гена, используя методику перекрывающихся участков. Эту методику мы отработали, еще когда изучали неандертальскую мтДНК. Затем Алекс взялся сравнить полученную последовательность с соответствующими цепочками африканских и индийских слонов, ближайших родственников мамонта. У меня тогда по поводу загрязнений началась прямо-таки паранойя, и я запретил Алексу и вообще кому-то из лаборатории работать с ДНК слонов до тех пор, пока Алекс не получит результат по мамонтам. И вот теперь, выйдя наконец из “чистой комнаты”, Алекс занялся секвенированием гена 28S рДНК слонов, применив тот же праймер, что и для мамонта. И получил ту же последовательность. Соответствующий фрагмент ДНК африканских слонов отличался все же по двум позициям, что говорило о том, что мамонты ближе к индийским, чем к африканским слонам. Мы, конечно, сравнили мамонтов со слонами, но не это являлось целью всей затеи: нам нужно было выделить древнюю ядерную ДНК. Чтобы подтвердить возраст, мы отправили ткань зуба того мамонта на углеродное датирование. И когда в ответном сообщении открылось “14 тысяч лет”, я в первый раз за много месяцев удовлетворенно расслабился. Так мы впервые в истории получили ядерную ДНК позднего плейстоцена.