Наука и жизнь, 2000 № 05 - [6]
— Каким же микроинструментом он вставлял в свою искусственную нить и сшивал нужные ему атомные блоки — нужные нуклеотиды? Ведь это же работа для Левши — соединять нуклеотиды поштучно…
— Никто, конечно, атомы пинцетом не берет и в цепочку их не вклеивает, наращивание полимерной цепи происходит в пробирке, причем сразу с большим количеством полимерных цепочек. В упрощенном виде все выглядит так.
В пробирку заливают раствор химического соединения с, так сказать, открытым первым нуклеотидом нужной вам цепочки, с Т, например. Затем в пробирку добавляется раствор следующего нуклеотида, допустим, Ц, он соединяется с первым нуклеотидом Т, и получается двухзвенный участок нити — ТЦ. После этого все оставшиеся свободные нуклеотиды из раствора отмываются, в него добавляется третий нуклеотид, предположим, А, и получается уже трехзвенный участок — ТЦА. Опять отмывка остатков, добавление нового нужного нуклеотида, и так до тех пор, пока не будет собрана вся задуманная цепочка.
— Как все гениальное ошеломляюще просто. Но сам процесс, видимо, сложный и очень долгий…
— Ситуация типичная для нашего времени: великое изобретение стало рядовой технологией. Сегодня в исследовательских лабораториях уже никто сам не синтезирует для себя нужные куски ДНК. Их заказывают в специализированных фирмах, которые используют полностью автоматизированные промышленные синтезаторы. Так что любые нужные цепочки нуклеотидов синтезируются сейчас без участия людей — автоматами, роботами. Заказы выполняются быстро, и стоит все это недорого.
— Любопытно, сколько же? Хотя бы порядок величины…
— Примерно 30 центов за нуклеотид, то есть несколько долларов за участок гена, чаще всего нужный в лаборатории — за так называемый праймер длиной в несколько десятков нуклеотидов.
— Так и бриллианты скоро начнут продавать по доллару за килограмм…
— Второе изобретение сделал английский химик Фредерик Сенгер, кстати, единственный, кто получил две Нобелевские премии по химии: в 1958 году — за секвенирование белков и через двадцать с лишним лет — за секвенирование ДНК. За этим термином — «секвенирование» — стоит чрезвычайно важная процедура: точное определение места конкретных «типовых» блоков в полимерной нити белка или нуклеиновой кислоты. Иными словами, секвенирование позволяет составить своего рода карту большой молекулы — точно определить последовательность ее основных блоков, в частности последовательность нуклеотидов в нити ДНК. Сам термин «секвенирование» происходит от латинского sequor — следовать.
— А как проводится секвенирование?
— Операция непростая, многоступенчатая, но в двух словах выглядит она так. В пробирке идет нормальный синтез полимерных нитей ДНК и в какой-то момент его останавливают, причем так, что известен тип нуклеотида, оказавшийся на конце, — А, Г, Т или Ц. Затем получившиеся отрезки нити давно известным способом собирают в группы, в которые входят полимеры одной и той же длины, и, наконец, с помощью точных лазерных приборов измеряют эту длину. Вот и все — теперь вы знаете концевой нуклеотид в отрезках разной длины и знаете, на каком расстоянии от начала полимерной нити этот нуклеотид находится. Иными словами, вы знаете последовательность нуклеотидов. Это, конечно, недопустимо упрощенное описание, имеющее целью не более чем пояснить суть дела…
— Неужели все эти тонкие операции тоже автоматизированы?
— Именно так. Я вам сейчас прямо у нас в лаборатории покажу автомат, выполняющий секвенирование, — он не больше телевизора.
И, наконец, третье великое изобретение, оно сокращенно называется ПЦР, и сделал его американец Кари Мулис сравнительно недавно, лет пятнадцать назад. Он буквально совершил переворот как в самой биотехнологии, так и в некоторых областях от нее, казалось бы, далеких.
Упрощенная схема ПЦР — полимеразной цепной реакции, позволяющей получать практически неограниченное количество копий любого участка ДНК. В пробирку помещают пробу ДНК (а) и вместе с ней так называемые праймеры, или затравки, заранее подготовленные синтетические кусочки одной нити ДНК, точно совпадающие по строению с концами того отрезка ДНК (гена), который надо размножить. Кроме того, в раствор добавляют нуклеотиды — строительные блоки ДНК и фермент полимеразу. Раствор нагревают до 95 °C, и нити ДНК расходятся (б). Смесь охлаждают до 50–65 °C, тогда праймеры прикрепляются к своим участкам ДНК на каждой нити (в). Температуру поднимают до 72 °C, и полимераза начинает присоединять к праймеру нужные нуклеотиды из раствора, пользуясь нитью ДНК как шаблоном (г). Получается точная копия участка ДНК от одного праймера до другого, то есть вместо одной двойной нити ДНК две такие нити (д). Цикл изменения температуры можно повторять сколько угодно (он занимает несколько минут), и каждый раз число нитей ДНК удваивается. Через 30 циклов мы получаем около миллиарда копий нужного гена.
— Например…
— Например, в криминалистике. Аббревиатура ПЦР расшифровывается, как полимеразная цепная реакция. Суть процесса в том, что, начав с одного-единственного фрагмента ДНК, вы копируете его и увеличиваете количество копий именно в режиме цепной реакции: после первого цикла у вас уже есть 2 фрагмента, после второго цикла — 4, после третьего — 8, после четвертого — 16, затем 32, 64, 128, 256… С каждым циклом происходит удвоение числа копий, и после двадцати циклов счет уже идет на миллионы, а после тридцати — на миллиарды. Цикл длится считанные минуты и сводится к определенному изменению температурного режима в очень небольшом химическом реакторе. Здесь в растворе в достаточном количестве находятся все нужные компоненты синтеза, прежде всего, нуклеотиды А, Г, Т и Ц, а также проведены тонкие подготовительные химические операции для того, чтобы с каждого готового отрезка ДНК тут же снималась точная копия, затем с этой копии — снова копия, в этом и состоит разветвленная цепная реакция.
