Клещевые инфекции в Беларуси - [12]

Диагностика

Клиническое распознавание КЭ на первом этапе основывается на известных клинико–эпидемиологических данных. В большинстве наблюдений удается установить предшествующее пребывание человека в лесу, укус клещом или употребление им сырого контаминированного молока. Сразу оценивается вероятная продолжительность инкубационного периода, а клинические исследования могут выявить нейроинфекционный характер болезни. Предварительный диагноз должен быть подтвержден лабораторными методами (ИФА, ПЦР).

Даже однократное определение высокой концентрации вирусспецифических иммуноглобулинов класса IgM в методе ИФА следует считать достоверным свидетельством в пользу клинического диагноза КЭ. Ранние антитела IgM в сыворотке пациентов выявляются, начиная с первых дней после укуса клеща. Диагностическая ценность ИФА для выявления вирусспецифических антител класса IgM максимальна в первой десятидневке после инфицирования. Антитела класса IgG в максимальных титрах выявляются в течение 2–6 мес. после инфицирования. Следует иметь в виду возможность обнаружения специфических антител в низких титрах в течение длительного времени у вакцинированных. Поэтому для подтверждения диагноза часто рекомендуется применение высокочувствительного ПЦР–анализа для определения РНК ВКЭ. Определение вирусной РНК при КЭ в образцах сыворотки, ликвора, в зависимости от сроков выявления и корреляции с определенными соотношениями уровней специфических антител IgM и IgG, может служить для диагностики серонегативной формы КЭ, затяжной реконвалесценции, прогноза второй волны лихорадки КЭ и возможности хронизации процесса.

Внутри–, межочаговая и региональная генетическая гетерогенность ВКЭ приводит к широкому структурному разнообразию эпитопов каждого из антигенов вируса. В результате среди циркулирующих в природе штаммов вируса значительную часть составляют антигенно–дефектные варианты. Сущность явления антигенной дефектности заключается в отсутствии гемагглютинирующего и преципитирующего антигенов и слабой иммуногенности на фоне высокой инфекционной активности вируса. В этих условиях основу иммунологических методов анализа специфических вирусных антител составляют реакции связывания только вируснейтрализующих антител, продуцируемых у лиц, инфицированных антигенно–дефектными вирусами в низких титрах. В природных популяциях ВКЭ доля соответствующих дефектных штаммов может достигать 30–40%. Лица, инфицированные антигенно–дефектными штаммами, в клинике образуют группу т.н. серонегативных больных и больных с низкими стабильными титрами.

При иммунологических методах определения ВКЭ некоторая неопределенность в оценке результатов анализа также возникает из–за того, что препараты меченых антител могут связываться с вирусами различных серотипов ВКЭ с разной эффективностью. Также требуется проверка специфичности меченых антител относительно реакции связывания с другими флавивирусами группы клещевого энцефалита. По этим причинам в последнее время в производстве ИФА–диагностикумов для клинического анализа в качестве меченых антител к ВКЭ используются моноклональные антитела, связывающиеся с определенным эпитопом Е–антигена ВКЭ, общим для известных серотипов этого вируса.

Для диагностики КЭ используется метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с ПЦР – геномная РНК ВКЭ определяется с применением молекулярных зондов – меченых фрагментов нуклеиновой кислоты, комплементарных к определенным участкам генома ВКЭ. Преимущества анализа РНК ВКЭ перед методом биопробы и анализом антигенов вируса иммуноферментным методом или методом флюоресцирующих антител очевидны.

Метод молекулярной гибридизации – более высокочувствительный тест: вирусная РНК выявлена из 50,9% исследованных проб крови больных с острым течением КЭ. При исследовании тех же образцов крови методом биопробы на беспородных белых мышах инфекционный вирус выявлен в 23,4% случаев. Столь значительное расхождение в результатах анализов в сыворотке объясняется возможной маскировкой вируса за счет формирования иммунных комплексов. В процессе депротеинизации при выделении РНК из анализируемого образца нуклеопротеиновые комплексы диссоциируют, и освобождающаяся вирусная РНК увеличивает частоту положительных результатов гибридизационного анализа. Более частое выявление РНК ВКЭ в крови больных может быть обусловлено также значительно более активным, чем репликация инфекционных вирионов, синтезом вирусной РНК в инфицированной клетке.

Рис. 3. Алгоритм диагностики клещевого энцефалита.

Для диагностики КЭ используется наиболее чувствительный вариант ПЦР–анализа – метод обратной транскрипции с последующей «nested» полимеразной цепной реакцией (ОТ–ПЦР).

Чувствительность анализа – 100–200 геномов ВКЭ на исследуемую пробу. Сверхчувствительный ПЦР–анализ РНК позволяет надежно с высокой специфичностью выявлять ВКЭ в исследуемых образцах, содержащих вирус в десятки–сотни тысяч раз в меньших количествах, чем это позволяет выявлять ИФА–анализ антигена ВКЭ.

Для проведения лабораторного ПЦР–анализа РНК ЗАО «Вектор–Бест» выпускает дополнительный набор реагентов, специально предназначенный для выделения РНК из биологических образцов (крови, сывороток крови, форменных элементов крови, мочи, слюны, ликвора, соскобов со слизистой, культур клеток).