Как мы видим? Нейробиология зрительного восприятия - [21]

За советом я обратился к Элио Равиоле, старшему сотруднику кафедры нейробиологии Гарвардского университета, магу нейроанатомии. Мой вопрос состоял в следующем: может ли электронная микроскопия (одно из многочисленных искусств, которыми он владел) помочь нам увидеть различия между нейронами? Конечно, ответил он, но это потребует невероятно кропотливого труда: кому-то придется сидеть за специальным резаком (микротомом), делать с образцов сетчатки десятки тысяч ультратонких срезов и затем исследовать их под микроскопом. Поскольку у Элио были дела поважнее, он направил меня к своей итальянской ученице Энрике Стреттои. Энрика оказалась талантливым молодым ученым, абсолютно бескомпромиссным в отношении науки. Вместе с Равиолой они провели потрясающее исследование нейронных связей в сетчатке с использованием электронной микроскопии серийных срезов. Энрика привнесла в нашу команду свои навыки, дисциплину и страсть, а также подсказала ключевую идею, благодаря которой мы сумели достичь нашей цели.

«Нам не нужно гробиться над анализом высокого разрешения, – сказала она. – Зачем возиться с тонкостями строения каждой клетки? Давайте просто идентифицировать клетки по их корневым дефинициям – по путям их отростков к синаптическим слоям сетчатки». В масштабе электронной микроскопии отростки нейронов выглядят огромными. Если на то пошло, заметила Энрика, их можно хорошо разглядеть даже через оптический микроскоп с максимальной разрешающей способностью. В этом случае потребуется гораздо меньше серийных срезов, потому что срезы для оптической микроскопии могут быть в десять раз толще, чем для электронной, и охватывать гораздо более обширные области. Таким образом, тестовые образцы сетчатки, по сути, представляли собой трехмерные сплошные объекты, чью внутреннюю структуру мы собирались изучить на основе двухмерных изображений их срезов (в наши дни цифровой визуализации это не представляло бы большого труда, но в те времена все было намного сложнее). Нашей целью было точно идентифицировать все до единой клетки в тестовых образцах.

Взяв подготовленные нами в Бостоне ткани сетчатки, Энрика вернулась в Пизу и принялась за работу. Она делала бесконечные серии срезов и фотографировала каждый срез под микроскопом. Негативы она отправляла нам в Бостон обычной международной почтой (благословенные технологии цифровой фотографии и электронной почты появились только после окончания этого проекта). Еще одним членом нашей команды была Ребекка Рокхилл, мой лаборант. Ребекка трудилась самоотверженно: когда я попросил ее отпечатать несколько тысяч фотографий, она молча закрылась в темной комнате на пять недель и в конце концов вышла из нее с толстенными пачками глянцевых фотографий размером 21,5 на 22 см, все еще источавших едкий запах фотореактивов.

Сидя за длинным столом, мы перебирали стопки снимков, скрупулезно отслеживая каждую клетку. Процесс происходил так: на фотографии № 1 вы видели множество клеточных тел нейронов – неправильной формы профили, срезанные в разных местах. Вы выбирали любую клетку, после чего брали фотографию № 2 и находили на ней ту же клетку, срезанную немного на другой глубине. Затем вы брали фотографию № 3, снова находили эту клетку и т. д., пока на очередной фотографии не обнаруживали выходящий из тела клетки отросток – аксон или дендрит. Теперь вам нужно было отследить, куда идет этот отросток – вверх к фоторецепторам или вниз к ганглионарным клеткам? Вы находили этот отросток на следующей фотографии и на следующей, прослеживая его траекторию до внутреннего или наружного синаптического слоя. Постепенно отросток становился все тоньше и тоньше и в конце концов исчезал. Разумеется, мы не могли проследить аксоны и дендриты до самых их окончаний, поскольку они становились слишком тонкими, чтобы их можно было зафиксировать на фотографии. Но мы могли проследить их достаточно далеко, чтобы с уверенностью сказать, идут ли они к внутреннему или наружному сетчатому слою.

Определение траекторий всех отростков клетки позволяло нам с высокой степенью надежности идентифицировать ее как биполярную, амакриновую или горизонтальную клетку. Мы опирались на корневые характеристики типов клеток: амакриновая клетка протягивает свои отростки только во внутренний синаптический слой сетчатки; горизонтальная клетка – только в наружный; биполярная клетка – в оба слоя.

Затем мы возвращались к первой фотографии и на теле клетки фломастером писали букву «Б» для биполяров, «А» для амакринов и «Г» для горизонтальных клеток. Если это была первая клетка того или иного типа, мы писали «Б1», «А1» или «Г1», после чего переходили к следующей.

Часть этой колоссальной работы проделал я сам, остальное сделали студенты, проходившие у меня летнюю практику. (Если вы думаете, что я испортил студентам лето и навсегда отбил у них вкус к нейробиологии, то это не так. По меньшей мере двое из них стали ведущими нейробиологами.) Поскольку каждой идентифицированной нами клетке присваивался свой инвентарный номер, который указывался на фотографиях, мы всегда могли вернуться и проверить свои выводы. Таким образом, мы вели предельно строгий учет: идентифицировали каждую клетку в образцах ткани из середины сетчатки и подсчитывали точную долю амакриновых, биполярных и горизонтальных клеток. Мы были абсолютно уверены в точности результатов.