История биологии с начала XX века до наших дней - [264]

Поскольку большинство вирусов увидеть при помощи светового микроскопа нельзя, усилия ученых на первых этапах были направлены на изучение более крупных образований, которые формируют некоторые вирусы в пораженных клетках. Подобные включения были описаны еще и XIX в. при контагиозном моллюске человека, при оспе птиц (О. Боллингер) и при оспе человека (Г. Гварниери). В 1903 г. А. Негри описал своеобразные тельца, выявляемые в протоплазме нервных клеток при бешенстве. В 1921 г. Б. Линшютц классифицировал вирусные включения по их местоположению в ядре или цитоплазме клетки. Вирусы оспы и бешенства, например, формируют включения в цитоплазме, аденовирусы и герпетические вирусы — в ядре, а вирус кори — в ядре и цитоплазме. Было установлено, что включения различаются по своей структуре. Они могут представлять собой места синтеза вирусных компонентов (основные вирусы), агрегаты вирусных частиц (аденовирусы) или являться следствием нарушенного клеточного обмена (при герпетической инфекции).

Впервые непосредственно вирусные частицы удалось увидеть Дж. Буисту в 1887 г. при исследовании материала от оспенного больного; возбудитель оспы относится к наиболее крупным вирусам, размеры которого находятся на границе разрешающей способности светового микроскопа.

До 1931 г. выделение и культивирование вирусов человека и животных осуществлялось почти исключительно путем заражения восприимчивых животных. Имелись отдельные успешные попытки размножения вирусов в клеточных культурах (осповакцины, ящура), однако ввиду сложности техники они не нашли сколько-нибудь широкого применения.

Путем заражения животных были изолированы и изучены возбудители оспы, бешенства, простого герпеса, гриппа, полиомиелита, лимфоцитарного хориоменингита, желтой лихорадки, ряда клещевых и комариных энцефалитов, энцефаломиелитов лошадей и некоторые другие. Однако этот метод не позволял получать вирус в больших количествах, необходимых для его детального изучения; к тому же большие трудности представляла очистка материала от тканевых фрагментов. Кроме того, далеко не все вирусные инфекции удавалось воспроизвести на лабораторных животных.

Толчком для дальнейшего развития вирусологии послужило открытие в 1931 г. А. Вудраффом и Е. Гудпасчуром возможности культивировать вирус оспы кур в развивающемся курином эмбрионе. Было установлено, что очень многие вирусы хорошо размножаются в этих условиях, накапливаясь в хорионаллантоисной оболочке и жидкостях эмбриона. Очистка вируса от аллантоисной жидкости оказалась сравнительно простой. К тому же у некоторых вирусов (например, ряда представителей оспенной группы) была обнаружена способность вызывать на хорионаллантоисной оболочке очаговые поражения, по числу которых можно весьма точно определить титр вируса.

В 1941 г. Г.К. Херст обнаружил у вируса гриппа способность склеивать эритроциты кур. В дальнейшем у многих вирусов была установлена способность агглютинировать эритроциты тех или иных млекопитающих и птиц. Это дало в руки вирусологов простой метод количественного определения многих вирусов и соответствующих антител.

В 30-е годы были разработаны новые методы исследования вирусов. В 1939 г. М. фон Арденн и X. Руска предложили метод электронномикроскопического исследования вирусных частиц, находящихся во взвеси. Позже была разработана методика получения ультратонких тканевых срезов, позволяющая исследовать электронномикроскопически вирусы внутри пораженных клеток. Для получения концентрированных вирусных суспензий стали использовать центрифугирование при большом числе оборотов. Путем измерения скорости осаждения различных вирусов оказалось возможным определить их размеры и вес. В 1933 г. У.Дж. Элфорд предложил использовать для определения размеров вирусов коллодийные мембраны с различной величиной пор. После получения ВТМ в кристаллическом виде было установлено, что формировать кристаллические структуры могут и некоторые мелкие вирусы позвоночных, например вирус полиомиелита.

Совершенно исключительное значение для развития вирусологии имела предложенная в 1949 г. Дж. Эндерсом, Т. Уэллером и Ф. Роббинсом методика получения однослойных клеточных культур из обработанных трипсином тканей. Она позволяет выращивать практически любые типы клеток. Выращенные в культуре клетки нередко обладают значительно более широким спектром восприимчивости по отношению к различным вирусам, чем те же клетки в организме. При инокуляции достаточной дозы вируса оказалось возможным инфицировать одновременно все клетки однослойной культуры. Это позволило получать вирус в высоком титре, к тому же с небольшой примесью клеточных белков. Большинство вирусов при развитии в однослойных культурах вызывает дегенерацию клеток («цитопатический эффект»). Это явление стали широко использовать для титрования вирусов и антител.

Р. Дюльбекко и М. Фогт (1952) разработали на основе однослойных клеточных культур методику получения под слоем агара или другого геля колоний вируса (бляшек), образующихся из одной инфекционной вирусной частицы. Метод позволил производить точный подсчет количества инфекционных вирусных частиц, а также выделять отдельные клоны вируса, что необходимо при генетических и иных исследованиях.