История биологии с начала XX века до наших дней - [261]
Открытие фага ϕХ174, содержащего однонитчатую ДНК (Р. Синсхеймер, 1959), не только не опровергло, но, наоборот, подтвердило универсальность полуконсервативного механизма репликации ДНК у вирусов бактерий. Оказалось, что после проникновения в клетку одноцепочечной ДНК фага ϕХ174, так называемой «плюс»-цепи, на ней формируется комплементарная ей «минус»-цепь и в результате образуется двухцепочечная репликативная форма. «Минус»-цепь и служит матрицей для синтеза информационной РНК фага ϕХ174 (Р. Синсхеймер, 1968).
В 1968 г. М. Гулиан, А. Корнберг и Р. Синсхеймер, используя препараты ДНК-полимеразы и лигазы из Е. coli, осуществили репликацию ДНК фага ϕХ174 de novo.
Генетические исследования с использованием большого числа различных мутаций фагов Т2 и Т4 показали, что все их гены имеют одну группу сцепления (Р. Стрейзингер, В. Брюс, 1960). В 1963 г. Р. Стрейзингер, Р. Эдгар и Г. Денхардт при тригибридном скрещивании различных мутантов фага Т4 обнаружили, что между генетическими локусами, расположенными в крайних точках линейной карты, рекомбинанты не образуются. Отсюда они сделали вывод, что генетическая карта этого фага представляет кольцо. Применение условно-летальных мутантов, открытых у фага Т4, соответствующие мутации которых располагаются во всех секторах карты, позволило получить более точное представление о генетической карте фага Т4.
Кольцевая генетическая карта фага Т4 (по Г. Стенту, 1971).
Построена на основе сравнительного анализа сцепления на «исторической карте» и на картах условнолетальных am- и ts-мутаций.
Важное значение для развития молекулярной генетики вирусов бактерий имели работы С. Бензера (1955), установившего тонкое строение гена rII фага Т4. Он показал, что этот ген состоит из двух функциональных участков, названных им цистронами А и В, которые содержат по 1000-15 000 нуклеотидов. Каждый цистрон состоит из большого числа единиц мутаций (мутонов) и рекомбинаций (реконов). Мутон, по мнению автора, соответствует одному нуклеотиду, а рекон — шести.
Таким образом, работы Бензера позволили представить ген и его компоненты в виде определенного числа нуклеотидов. Обнаружение в гоне rII фага Т4 двух рядом расположенных цистронов привело к изменению представлений о природе связи между геном и определяемым им признаком. Вместо установленной биохимической генетикой зависимости «один ген — один фермент» получает признание формула «один геи — один полипептид», согласующаяся с данными о наличии в ряде активных белков нескольких полипептидных цепей. Выявление определенного порядка локализации цистронов в области rII фага Т4, контролирующего синтез активного белка, пролило свет на механизм связи между геном и ферментом: линейный порядок расположения цистронов обусловливает последовательный синтез соответствующих полипептидов, входящих в состав активного белка.
Работы Бензера способствовали решению проблемы генетического кода и познанию механизма мутаций. Именно используя область гена rII фага Т4 в качестве модели, Ф. Крик, Л. Барнет, С. Бреннер и Р. Уоттс-Тобин (1961) установили общую природу записи генетической информации для белков, а Э. Фриз (1961), С. Бреннер, Л. Барнет и Л. Оргель. (1961) выяснили природу точечных мутаций (см. главу 24).
В 1961 г. Н. Циндер и Т. Лёб открыли новый класс вирусов бактерий. Они выделили фаги f1 и f2, размножающиеся только в мужских штаммах бактерий (F>+ и Hfr). Подобное ограничение обусловлено тем, что для адсорбции этих фагов необходимы F-пили, находящиеся только на поверхности мужских бактерий. Детали механизма проникновения фагов f1 и f2 не выяснены. Вскоре были открыты другие фаги, специфичные к мужским штаммам; многие из них напоминают f1 или f2. С фагом f1 оказались сходны фаги fd, М13 и F12, с фагом f2 — фаги MS2, fr и R27. Поэтому эти два семейства фагов условно обозначают символами f1 и f2.
Фаг f1 оказался мелким фагом, содержащим одноцепочечную ДНК, как и фаг ϕХ174. Но в отличие от последнего он содержит вдвое больше белка и имеет форму длинной изогнутой палочки. Механизм репликации ДНК фага f1 такой же, как у фага ϕХ174.
Фаг f1 отличается от всех вирусов бактерий способом его выделения из зараженной клетки-хозяина: секретирующие его клетки Е. coli продолжают расти и размножаться и никакого лизиса при этом не происходит. Так, спустя более 20 лет после того, как в опыте с одиночным циклом размножения фага было доказано высвобождение фагов только путем лизиса клетки, оказалось, что сторонники гипотезы «секреции» не так уж сильно ошибались.
Лёб и Циндер (1961) установили, что фаг f2 является мелкой сферической частицей, содержащей одноцепочечную РНК. Знание механизма репликации одноцепочечной молекулы ДНК фага ϕХ174 навело авторов на мысль, что в зараженных фагом f2 клетках РНК может находиться в двухцепочечной репликативной форме, что было установлено при помощи меченых атомов и седиментационного анализа. Авторы предложили следующую схему механизма репликации РНК фага f2. Одноцепочечная родительская цепь РНК, так называемая «плюс»-цепь, используется в качестве матрицы для синтеза комплементарной «минус»-цепи; в результате образуется двухцепочечная репликативная форма, «минус»-цепь которой служит матрицей для синтеза «плюс»-цепей РНК. До окончания синтеза первой дочерней «плюс»-цепи на репликативной форме начинается синтез второй, третьей, четвертой дочерних «плюс»-цепей. В итоге репликативная форма превращается в так называемый репликативный промежуточный продукт, состоящий из двухнитчатой РНК и нескольких однонитчатых РНК. На поздних этапах латентного периода содержание репликативной формы и репликативного промежуточного продукта достигает окончательного уровня, число частиц увеличивается, пока процесс репродукции не завершается лизисом клетки.
