Геном человека: Энциклопедия, написанная четырьмя буквами - [18]

Сама процедура ПЦР заключается в следующем. Прежде всего, ДНК денатурируют, нагревая ее до 98°С. При этом две цепи ДНК, относительно слабо связанные между собой, разделяются друг от друга. Далее в ход идут так называемые затравки (праймеры) — короткие однонитевые фрагменты ДНК, которые комплементарны краям того участка генома, который собираются размножать (амплифицировать). Эти затравки гибридизуются с комплементарными участками однонитевых молекул ДНК, после чего специальный фермент (ДНК-полимераза) удлинняет затравки, строя молекулу ДНК по матрице (цикл 1). Затем продукты реакции вновь денатурируют и процедуру повторяют необходимое число раз. За 20–30 циклов из одной молекулы можно получить миллионы копий ДНК. Этот процесс подобен цепной ядерной реакции, но осуществляется в пробирке с помощью специального фермента — термостабильной ДНК-полимеразы. По этой причине он и получил название полимеразной цепной реакции.

Рис. 14. Схема протекания полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Конечная цель — определение полной последовательности нуклеотидов в ДНК человека

Длительное время искали эффективные методы, позволяющие определять последовательность нуклеотидов в длинных молекулах ДНК (такое определение нуклеотидной последовательности получило название секвенирование, от анг. sequence — последовательность). Только в середине 70-х годов секвенирование протяженных участков ДНК стало возможным. Связано это было с изобретением принципиально новых подходов. В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод прямого секвенирования, основанный на химической деградации ДНК. В данном случае осуществляется специфическая химическая фрагментация длинной цепи ДНК (полинуклеотида), радиоактивно меченной с одного конца. Затем препарат меченой ДНК разделяют на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований, содержащихся в ней. После разделения в специальном геле меченых фрагментов по размерам (с помощью электрофореза) на рентгеновских пленках смотрят, что при этом происходит с нуклеотидной последовательностью, и на основании этого делают вывод о порядке расположения нуклеотидов друг за другом в каждом фрагменте ДНК. Однако метод оказался довольно сложным. В становлении этого метода на его начальных этапах существенную роль сыграл российский ученый академик А. Д. Мирзабеков, работавший в лаборатории У. Гилберта.

Чуть раньше английский ученый Фред Сэнгер предложил иной способ расшифровки структуры ДНК, который в конечном итоге после разных модификаций стал основным. Согласно методу Сэнгера молекулу ДНК с помощью специальной обработки ферментами не только расщепляют на фрагменты, но и «расплетают» ее двойную спираль на две нити. Потом по каждому из полученных обрывков «нитей» с помощью специальных затравок восстанавливают недостающую вторую нить ДНК. При этом синтез второй нити осуществляется не полностью, а с помощью специального приема обеспечивается прекращение синтеза строго на одном из 4 нуклеотидов. В результате этого получался набор цепей ДНК с разной длиной — «лесенка». Эта «лесенка» становится видимой глазом после разделения всех фрагментов по размерам за счет того, что концы всех фрагментов содержат специфическую — или радиоактивную, или флуоресцентную метку. Следует отметить, что в разработку этого поистине революционизирующего метода существенный вклад был сделан и двумя российскими учеными: профессором С. К. Василенко и академиком Е. Д. Свердловым.

За разработку методов секвенирования Гилберт и Сэнгер получили Нобелевскую премию. Интересно, что для Сэнгера эта была уже вторая премия, первую он получил за расшифровку аминокислотной последовательности первого белка — инсулина.

Все автоматы-секвенаторы, которые появились позднее, были построены по принципу метода Сэнгера, поскольку он оказался более удобным для автоматизации процесса и компьютерной регистрации результатов. В настоящее время ряд крупных фирм занимается производством таких автоматов, а также стандартных наборов реактивов для анализа ДНК. Секвенирование стало достаточно рутинной лаборантской работой. А метод Максама–Гилберта имеет сейчас скорее историческое, чем практическое значение.

Во всех случаях основное правило заключается в том, чтобы в препарате ДНК, который собираются секвенировать, все фрагменты имели, по крайней мере, один одинаковый конец, т. е. одну точку отсчета. В этот фиксированный конец вводят радиоактивную (или флуоресцентную) метку. После этого проводят дальнейшие специфические расщепления молекул с помощью ферментов или химических агентов по строго определенным азотистым основаниям. Условия расщепления при этом таковы, что на каждый меченый фрагмент в среднем приходится один разрыв. В результате после расщепления образуется набор фрагментов разной длины, каждый из которых начинается в точке отсчета, а заканчивается на или перед определенным типом нуклеотида.

Полученные фрагменты разделяют по размерам с помощью электорофореза в гелях. Маленькие фрагменты движутся быстрее более крупных, и в результате такой процедуры все фрагменты выстраиваются друг за другом в зависимости от своей длины. Результат такого разделения изображен схематически на рис. 15.