Генеалогия нейронов - [6]

Крайне медленный прогресс в работе по обнаружению холинергических клеток головного мозга объясняется методическими трудностями.

В течение многих лет идентификацию холинергических структур связывали с гистохимическим выявлением активности ацетилхолинэстеразы. Простота этого подхода оказалась кажущейся. Только в редких и специальных случаях высокая активность ацетилхолинэстеразы наблюдается в нейронах, секретирующих ацетилхолин, — значительно чаще, но тоже не всегда, фермент располагается в структуре, на которую действует медиатор, т. е. за синаптической щелью. Далее, имеется огромная литература о выявлении ацетилхолинэстеразы в таких соединениях, где ни пре-, ни постсинаптическая клетки не являются холинергическими. Наконец, накопилось немало сведений о том, что присутствие этого фермента в нейронах вообще может не иметь отношения к синапсам и синаптической передаче. Всё это обязываеткрайне критически относиться к обширной литературе о «холинергических нейронах», идентифицированных столь ненадёжным способом.

Несравненно ценнее для идентификации сведения об активности ключевого фермента синтеза ацетилхолина — холинацетилазы (ацетилтрансферазы холина). Сделаны первые шаги в разработке методов гистохимического обнаружения этого фермента. Они ещё несовершенны, но во всяком случае специфичны: так, у крысы продукт гистохимической реакции выявляется в холинергических спинальных мотонейронах, но его нет в нехолинергических клетках спинальных ганглиев [см. 180]. Можно рассчитывать, что дальнейшее развитие гистохимии холинацетилазы, а также использование и совершенствование методов микрохимического определения активности этого фермента [169, 241] и содержания ацетилхолина в отдельных нейронах [241а] позволят уверенно локализовать холинергические нейроны и их связи.

В синапсах, для которых установлена медиаторная функция ацетилхолина (моторные окончания на скелетных мышцах позвоночных, парасимпатические окончания в сердце и др.), секреторные органеллы относятся к одной и той же категории: это не имеющие плотного содержимого округлые пузырьки диаметром около 450-500 Å. Для дифференцирования между пузырьками, содержащими ацетилхолин, и внешне похожими на них пузырьками в окончаниях другой специфичности (в частности, в секретирующих глутамат) важно было бы обладать методом выявления самого ацетилхолина. Однако попытки, предпринимаемые в этом направлении, пока не увенчались успехом. Акерт и Сандри в 1968 г. дали повод надеяться на то, что такой метод найден, когда им удалось импрегнировать содержимое прозрачных пузырьков в нервно-мышечных и центральных синапсах смесью иодистого цинка с четырёхокисью осмия [75], но последующие исследования показали, что реакция выявляет не ацетилхолин и природа её избирательности неясна [см. 74]. Между тем из ацетилхолин-содержащих синаптических пузырьков, полученных из электрических органов рыб, выделили особый кислый белок, везикулин, в связи с чем было высказано предположение, что именно этот белок связывает цинк, обеспечивая электронно-микроскопическую импрегнацию полости синаптических пузырьков [345]. Если в самом деле метод выявляет кислые белки, то специфичность его не может быть очень высока.

Внутри синаптических пузырьков ацетилхолин вряд ли находится в растворенном виде, — скорее, он связан отрицательно заряженными противоионами, роль которых, возможно, играют упомянутый везикулин и АТФ [344, 345].

В холинергических окончаниях, наряду с прозрачными секреторными пузырьками, в гораздо меньшем числе встречаются гранулы диаметром около 800 Å, имеющие плотное содержимое. Они как будто не принимают участия в процессе секреции. Эти более крупные гранулы, в отличие от секреторных пузырьков, обнаруживаются не только в пресинаптическом окончании, но и в теле нейрона, а также по ходу аксона. Существует предположение, что в таких гранулах, образующихся в элементах аппарата Гольджи в теле холинергического нейрона, в аксонные окончания доставляются какие-то макромолекулы, необходимые для производства секреторных пузырьков [см. 295].

Итак, для обнаружения холинергических нейронов и синапсов применяют комплекс методов. В микроэлектродных исследованиях широко используются фармакологические агенты, в частности, вещества, влияющие на синтез, секрецию и рецепцию ацетилхолина. Гистохимики возлагают сейчас свои надежды на холинацетилазу. Можно думать, что этот фермент, как и другие специфические белки холинергических нейронов, в частности, везикулин, скоро будут обнаруживать и иммуногистохимическими методами. Электронная микроскопия пока позволяет идентифицировать холинергические окончания лишь приблизительно: холинергические пузырьки трудно спутать с секреторными органеллами моноаминергических или пептидергических окончаний, но трудно и дифференцировать от прозрачных пузырьков какой-то другой медиаторной специфичности. Наконец, существуют основанные на разных принципах методы обнаружения рецепторов ацетилхолина [см. 39], что позволяет косвенно судить о холинергической природе волокон, иннервирующих такие холинореактивные структуры. всё это хорошо, но остро чувствуется потребность в более простых, прямых и надежных способах обнаружения холинергических структур.