Эпигенетика - [7]

Теломеры оказались простейшей системой для более глубокого понимания того, каким образом белки Sir опосредуют сайленсинг. Была разработана концепция рекрутирования белков сайленсинга. Говоря коротко, оказалось, что белок Rap1, связывающийся с теломерной ДНК, взаимодействует с Sir3 и Sir4 двугибридным способом (by two-hybrid methods — описано в Palladino et al. 1993). Таким образом, Rap1 может «рекрутировать» эти белки Sir к теломерному району генома. Имелись данные о том, что Sir3 и Sir4 могут связываться друг с другом и что (и это особенно важно) Sir3 и, возможно, Sir4 взаимодействуют с «хвостами» гстонов H3 и Н4 (Thompson et al., 1993). Более того, сверхэкспрессия Sir3 заставляет его «распространяться» по хроматиновой фибрилле внутрь от теломеры, позволяя предполагать, что он является лимитирующим компонентом «молчащего» хроматина и может «полимеризоваться» вдоль хроматина (Renauld et al., 1993). Все вместе показывало, что существует, оказывается, обширная сеть взаимодействий, важная для сайленсинга, — белки Sir инициируют сборку на теломерной ДНК, благодаря их взаимодействию с Rap1, а затем полимеризуются от теломеры вдоль хроматинового волокна, предположительно связываясь с «хвостами» гистонов H3 и Н4.

Переключение между транскрипционными состояниями при мозаичной теломерной экспрессии оказалось результатом конкуренции в отношении экспрессии между «молчащими» и активными генами (Aparicio and Gottschling, 1994; описано в Weintraub, 1993). Если транскрипционный активатор для теломерного гена делегирован, базовый механизм транскрипции этого гена оказывается недостаточным для экспрессии, и этот ген оказывается конститутивно сайленсированным Наоборот, сверхэкспрессия активатора заставляла теломерный ген экспрессироваться постоянно — это ген никогда не был сайленсирован. В отсутствие SIR3 (или SIR2 или SIR4) базальная экспрессия гена была достаточной, тогда как увеличенная доза SIR3 повышала долю клеток, которые были сайленсированы. Хотя транскрипционный активатор мог преодолеть сайленсинг на протяжении всего клеточного цикла, он был наиболее эффективным, когда клетки были остановлены в фазе S — предположительно, когда хроматин реплицируется и, отсюда, оказывается наиболее чувствительным к конкуренции. Несколько удивляет, что клетки, остановленные на G₂/M, также можно было легко переключить, что заставляло предполагать, что «молчащий» хроматин еще не был полностью собран к этому времени.

Было показано, что «молчащий» хроматин у дрожжей не поддается действию нуклеаз и ферментов модификации ДНК; это позволяет предположить, что лежащая в его основе ДНК гораздо менее доступна, чем большая часть генома (описано в Thompson et al. 1993).

Оказалось также, что имеет место иерархия сайленсинга в геноме дрожжей: наиболее чувствителны к пертурбациям теломеры, затем идет HML, а наименее чувствителен HMR. Действительно, когда ген SIR1 мутировал, локусы НМ, в норме полностью сайленсированные, обнаруживали мозаичную экспрессию (Pillus and Rine, 1989).

Наконец, Sir3 и Sir4 были локализованы на периферии ядра, как и теломеры. Предположили, что ядро организовано таким образом, что ядерная оболочка обеспечивает специальную среду для сайленсинга (Раlladinoetal., 1993).

Schizosaccharomyces pombe тоже имеют «молчащие» кассеты типов спаривания, которые, как подозревают, ведут себя аналогично кассетам типов спаривания у S cerevisiae. Однако у S. pombe в истории с переключением типов спаривания был дополнительный поворот. В элегантной серии экспериментов Эймар Клар (Amar Klar) выдвинул предположение о том, каким образом в клетке «метка» импринтируется на одной нити ДНК (Klar and Bonaduce, 1993). Эта метка проявляется, после двух клеточных делений, в одной из четырех «внучатых» клеток как двунитевой разрыв, облегчающий переключение типа спаривания У этих дрожжей отсутствуют какие-либо известные модификации ДНК (метилирование и т. п.); отсюда постулируется, что на нити ДНК оставляется метка какого-то иного типа.

Темой 59-го симпозиума была «Молекулярная генетика рака». Концепция эпигенетической регуляции в онкогенезе начала развиваться после того, как утвердилась идея генов-супрессоров опухолей. Была опубликована пара исследований в пользу таких представлений, но интересный поворот в этой истории возник в исследованиях пациентов с синдромом Бэквита-Видеманна и опухолями Уилмса. Мутации у пациентов обоих типов были картированы в локусе, включавшем импринтированные гены H19-IGF2 Фейнберг с соавторами (Feinberg et al., 1994) открыл у таких больных «утрату импринтинга» (LOI — loss of imprinting) для этих генов — материнский локус утрачивал свой импринт, Н19 был репрессирован, a IGF2 — экспрессирован. Таким образом, LOI, которая в принципе могла бы происходить в других местах генома, могла вызывать либо биаллельную экспрессию, либо исчезновение генов, критичных для онкогенеза, либо и то и, другое.

Через пару лет на пути к 63-му симпозиуму на тему «Механизмы транскрипции» произошли важные события, которые впоследствии повлияют на понимание молекулярных механизмов нескольких эпигенетических феноменов. Были идентифицированы ферменты, модифицирующие гистоны, а именно, ацетилазы и деацетилазы гистонов Некоторые из этих энзимов играли критическую роль в регулировании экспрессии генов и позволили подойти к генным продуктам, непосредственно влияющим на PEVи сайленсинг. На симпозиуме была представлена верхушка этого айсберга (см. Losick, 1998). Молекулярное «расчленение» сайленсирующих белков Sir3 и Sir4 у дрожжей выявило поливалентную природу их взаимодействий и показало, каким образом сеть взаимодействий между всеми белками Sir, гистонами и разнообразными факторами, связывающимися с ДНК, формирует «молчащий» хроматин. Кроме того, были показаны молекулярные детали того, как разнообразные локусы (теломеры, рДНК, локусы