К концу княжения Василия Иоанновича III положение казачьих войск окончательно определилось. Значительная часть их влилась в состав московских владений, наполнила города категорией «бездомного люда», послужившей кадрами для формирования постоянных войск московских князей различного назначения: войска княжеской охраны, части служилых городовых казаков, и части, вооруженных огнестрельным оружием, получивших вначале название «пищальников», а затем — стрелецких полков. В составе московских вооруженных сил казаки сохраняли основы казачьей внутренней организации. Ближайшие их начальники ставились самими казаками, за исключением полковых и более высоких командных лиц, под названием «голов», назначавшихся великими князьями. Казачьи формирования пищальников и городовых служилых казаков с частями боярских детей и дворян составили первые постоянные войска московских князей. Условия несения службы казачьих частей и боярских детей были совершенно одинаковы. Они награждались землями, получали жалованье и имели некоторые льготы в продаже изделий кустарного производства и др. На таких же условиях формировались и части дворян, но земельные наделы они получали меньше. Служба в этих частях была наследственной, войска приносили присягу на службу великого князя. Они находились на содержании великого князя и селились в окрестностях Москвы, или других городов, на содержание которых они ставились.
Казачьи войска донских, гребенских и яицких казаков, живших вне пределов московских владений, были на положении совершенно независимом от Москвы. Отношения этих казачьих частей с Москвой опеделялись общими целями, общей обстановкой и договорами. Во время княжения Василия III отношения казаков с Москвой начинали только налаживаться, и ограничивались со стороны казаков донесениями об угрожающей опасности нападения со стороны Крыма и азиатских орд, а также сопровождением послов Москвы в Крым и обратно из Крыма в Москву.
Границы донских казаков с московскими владениями остались те же, которые были указаны Саро-Подонской епархией, митрополитами Феогностом и Алексеем в XIV столетии и проходили по рекам Хопер и Ворона. Между границами московских владений и землями донских казаков лежали большие пространства пустынных земель, и связь поддерживалась только дозорами городовых казаков, спускавшимися до пределов донских казаков. На юге границы низовых казаков граничили с Крымским ханством и кочевьем Малой ногайской орды. Расположенные в непосредственной близости к землям азиатских орд казаки были поставлены в условия постоянного военного напряжения и от них требовалось постоянное наблюдение за Казанью, Астраханью и Крымом. Верховые казаки должны были вести наблюдение за казанской ордой и Астраханью и ногайской ордой Заволжья. В значительно большем напряжении находилась часть низовых казаков. Ближайшей угрозой для них было Крымское ханство и Малая ногайская орда, кочевавшая между устьями Дона и Кубани.
Борьба между кочевым и оседлым миром еще не была окончена и последний находится все время под угрозой нападения со стороны азиатских орд. Крымское ханство было еще настолько сильно, что Москва и Литва были бессильны защищать от их нападений границы своих владений. Орды крымских ханов нередко вторгались глубоко в пределы своих соседей, доходили до Москвы, и московские вооруженные силы были бессильны отразить их нашествие. Казаки в борьбе с крымцами и другими кочевниками предоставлены были самим себе. Они должны были выдерживать борьбу против своих воинственных соседей рассчитывая исключительно на собственные силы. Для этой напряженной борьбы казаки должны были располагать не только хорошо подготовленными вооруженными силами, но их количеством. Городки низовых и даже верховых казаков часто подвергались нападениям конных орд в десятки тысяч, которые казаками отражались, и городки их никогда не занимались противником. Разрозненные в своем расселении, донские казаки оказались в военном отношении настолько сильными, что могли вести успешную войну против врага, от нападений которого Литва, Польша и Москва были бессильны защищать границы своих владений. Это были сильные и хорошо организованные казачьи войска.
Казаки, оказавшись в условиях независимого положения от монгольских ханов и Москвы, представляли хорошо вооруженные силы, по количеству достаточные для защиты своих земель, своего имущества и своих городков. Верховые казаки, очистив земли в начале княжения Василия III от устья Хопра до Волги, прочно занимали их и не позволяли кочевникам-ногайцам появляться в этих пределах. А низовые казаки так же успешно отражали нападения татарских орд, стремившихся очистить низовья Дона от их поселений.
Среди донских казаков была сильная прослойка населении татарского происхождения. Во время княжении Василия III среди их атаманов были известны многие с монголо-татарскими именами. По сведениям историка С. Соловьева, число атаманов с татарскими именами в большем количестве было среди верховых казаков. Прослойка татарского населения среди казаков была остатком правящего татарского слоя, сохранившегося со времени их господства. Со времени распада Золотой Орды и перехода казаков в положение независимого быта, монголы теряли свое значение, растворялись среди казаков и сливались с ними. Ко времени начала царствования Иоанна Васильевича во главе донских казаков, как верховых, так и низовых, становятся известными атаманы исключительно с русскими именами, как, например: Федоров, Заболотский, Янов, Черкашин, Ермак Тимофеевич и другие.
