В защиту науки (Бюллетень 2) - [68]

Научно обоснованные подходы: криобиология и современные репродуктивные технологии

Во времена, когда Роберт Эттингер писал свою книгу, т. е. в 1960-х гг., доминирующим методом замораживания было относительно медленное охлаждение биологических объектов (так называемое программное замораживание). Этот метод стал внедряться в практику после того, как случайно были обнаружены криопротективные свойства глицерина (Polge et al., 1949; Polge, Smith, 1950). Эти же криобиологи из Великобритании предложили метод замораживания и криоконсервации сперматозоидов, который с начала 1950-х начал активно внедряться в животноводство многих стран (Polge, Smith, 1950). Позже другие британские учёные показали, что преимплантационные эмбрионы (т. е. до момента имплантации в матку) млекопитающих тоже возможно подвергать замораживанию и криоконсервации (Whittingham et al., 1972; Wilmut, 1972). В наше время сотни тысяч эмбрионов крупного скота и других сельскохозяйственных животных подвергают криоконсервации (Thibier, 1998; 2002). Это существенно облегчает обмен генетическим материалом, в том числе интернациональный.

Криобиолог Петер Мэйзур и его ученики описали (математически и биологически) те процессы, которые происходят в ходе программного замораживания биологических объектов. Это теоретическое обоснование того, что уже использовали практики, а именно — метода постепенного (программного) замораживания, получило название "двухфакторной теории Мэйзура" (Mazur, 1977, 1988; Farrant et al., 1977). Данная теория была разработана с использованием достаточно сложного математического аппарата и была подтверждена множеством экспериментов. Согласно теории Мэйзура, основными повреждающими факторами при медленном замораживании является образование внутриклеточных кристаллов льда и экспозиция клеток в гиперосмотических растворах в течение процесса замораживания. Важными для практиков выводами этой теории является то, что повреждение клеток при замораживании зависит от проницаемости клеточной мембраны и скорости охлаждения (Mazur, 1977; Farrant et al., 1977).

Вскоре были разработаны оптимальные программы замораживания, которые различались как для отдельных типов замораживаемых объектов, так и для разных видов животных. Эти программы позволяли достаточно успешно замораживать клеточные суспензии (Rowe, 1994), сперматозоиды (Watson, 2000) и пре-имплантационные эмбрионы (Dobrinsky, 2002; Leibo, Songasen, 2002; Amstislavsky et al., 2006a) разных видов животных. При замораживании этих микроскопически мелких биологических объектов, согласно специально разработанным программам, образование внутриклеточных кристаллов льда минимально, так как внутриклеточная вода успевает выйти через клеточные мембраны, а экспозиция в гиперосмотических растворах (которые образуются, когда вода в жидкой фазе вокруг эмбрионов начинает кристаллизоваться в лёд) происходит в течение достаточно короткого времени, что не приносит большого вреда (Mazur, 1977; Farrant et al., 1977). Кроме глицерина для заморозки различных типов клеток применяют и другие криопротекторы, такие как диметилсульфокид, этиленгликоль и др. (Pedro et al., 2005). Показано, что разные криопротекторы обладают разной проницаемостью в клетки и мера их токсичности по отношению к клеткам зависит не только от времени экспозиции и типа клеток, но и от температуры (Wusteman et al., 2004).

Таким образом, оптимальные условия замораживания того или иного типа клеток обычно подбирают экспериментально; при этом, конечно, эксперимент строится с учётом основных положений теории Мэйзура. Наиболее «крупными» стадиями в развитии млекопитающих, которые когда-либо удавалось замораживать при помощи традиционных способов, описанных в этом параграфе, являются преимплантационные эмбрионы. Размер пре-имлантационных эмбрионов большинства видов млекопитающих — несколько десятых долей миллиметра, однако это уже многоклеточное образование и зачастую приходится прибегать к разным ухищрениям, чтобы достичь успеха. Тем не менее, эмбрионы лабораторных (Mobraaten, 1986), большинства сельскохозяйственных (Dobrinsky, 2002), некоторых пушных (Lindeberg et al., 2003; Amstislavsky et al., 2006), а также диких (Leibo, Songsasen, 2002) млекопитающих удается успешно заморозить и хранить при температуре жидкого азота. Сразу отметим, что под "успешной заморозкой" мы имеем в виду лишь те случаи, когда после крио-консервации при температуре жидкого азота эмбрионы были разморожены, трансплантированы самке-реципиенту и родилось живое потомство. Это единственный критерий, которому доверяет научное сообщество, все остальные критерии жизнеспособности эмбрионов после разморозки могут вызывать критику (вполне, на наш взгляд, обоснованную).

Когда программное замораживание, основанное на двухфакторной теории Мэйзура, попытались применить к более крупным объектам, чем ранние эмбрионы, то результаты заморозки были в подавляющем большинстве случаев отрицательными. Например, в обзорной статье Якобсена и Пегга сообщалось о попытке насыщения раствором криопротектора некоторых органов, таких, например, как почки, и последующего постепенного охлаждения их до температур -80 °C. Результат был негативным для всех исследованных органов (Jakobsen, Pegg, 1984). Причины неудач подобных экспериментов по применению традиционных программ замораживания при работе с органами перечисляются в ряде обзорных статей (Pegg, 2001; 2006). Органы состоят из разных типов клеток, причем между этими разными типами клеток имеются сложные межклеточные контакты. Каждый тип клеток имеет свои собственные криобиологические характеристики, и программа охлаждения, рассчитанная для одних клеток, может оказаться далеко не оптимальной по отношению к другим. Клеточные контакты особенно чувствительны и чаще всего необратимо разрушаются при применении традиционных программ заморозки. Самое же главное осложнение в применении теории Мэйзура к органам, состоит в том, что их величина измеряется не микронами и даже не миллиметрами. То есть соотношение поверхности и объема у этих органов очень далеко от оптимума. Напомним, что чем больше орган, тем меньше это соотношение поверхности и объема. Теория же Мэйзура хорошо «работает» лишь на объектах, имеющих радиус не более миллиметра.