Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века - [59]

Замечательной чертой результата Уонга, так же как и опытов Шора и Болдвина, является то, что он получен для изолированных молекул в растворе. Ведь со времени классической работы Р. Франклин все сведения о детальной структуре ДНК основывались на рентгеновских данных для волокон, в которых молекулы сильно взаимодействуют друг с другом.

Итак, ДНК в растворе находится в В-форме – в этом теперь уже нет никаких сомнений. Но это относится к несверхспирализованной ДНК. При сверхспирализации структура основной части молекулы не меняется заметным образом, но некоторые участки с характерными последовательностями могут радикально менять свою структуру. Вспомним про перевертыши и кресты, существование которых доказано экспериментально. А какие еще изменения структуры ДНК могут происходить? Прежде чем обратиться к этим темам, мы рассмотрим фундаментальный вопрос о том, какие силы удерживают две комплементарные цепочки вместе в двойной спирали.

Силы, стабилизирующие двойную спираль

Ответ на вопрос, поставленный в конце предыдущего раздела, может показаться тривиальным. В самом деле, очевидно, что те силы, которые обеспечивают образование комплементарных пар, А•Т и Г•Ц (рис. 38), и удерживают две цепочки друг около друга. Речь идет о так называемых водородных связях (Н-связях). Эти связи по своей силе занимают промежуточное положение между ковалентными связями, соединяющими атомы в молекулы, и чисто межмолекулярными взаимодействиями. Н-связи играют огромную роль и в ДНК, и в РНК, и в белках, и просто в чистой воде, особенно во льду. Именно способность молекул Н₂О образовывать друг с другом Н-связи обусловливает многие аномальные свойства воды, делающие ее столь необычной субстанцией.

Итак, кажется очевидным, что именно Н-связи между комплементарными основаниями удерживают две цепочки ДНК вместе. Так долгое время и считалось. В главе 3 было рассказано о плавлении ДНК, т. е. о расхождении комплементарных цепей при нагревании раствора ДНК. В полном соответствии с представлением о том, что водородные связи удерживают комплементарные цепи друг с другом, ДНК с большим содержанием Г•Ц-пар плавится при более высокой температуре. В самом деле, именно это и следовало ожидать, ведь в Г•Ц-паре имеется три Н-связи, а в А•Т-паре – только две (рис. 38). Причем температура плавления ДНК растет строго линейно с увеличением доли Г•Ц-пар в молекуле. Эта строго линейная зависимость ясно свидетельствовала о том, что стабильность участка двойной спирали зависит только от количества Н-связей в участке и не зависит от того, как Г•Ц – и А•Т-пары распределены вдоль цепи.

С другой стороны, те же данные по плавлению ДНК свидетельствовали о существенном взаимодействии между соседствующими вдоль цепи парами оснований, которое получило название стэкинг-взаимодействия (от английского слова stack, что значит «штабель, стопка»). Получалось, что по каким-то непонятным причинам все 10 стэкинг-взаимодействий между соседними парами оснований практически одинаковы, иначе бы нарушалась линейная зависимость температуры плавления от Г•Ц-содержания. Заметим, что всего контактов между соседними парами 16, но из-за правила комплементарности разных контактов 10: идентичны контакты АГ / ЦТ, ГА / ТЦ, АЦ / ГТ, ЦА / ТГ, АА / ТТ и ГГ / ЦЦ. Из данных по плавлению удалось извлечь различия в стэкинг-взаимодействиях между разными контактами, но эти различия рассматривались как малая поправка к основному эффекту: была полная уверенность, что двойная спираль стабилизируется главным образом Н-связями между коплементарными парами и различие в температуре плавления разных участков ДНК практически целиком определяется различием в содержании Г•Ц-пар между этими участками. На самом деле, как стало постепенно ясно, из данных по плавлению нельзя извлечь отдельно вклад в стабильность от спаривания оснований и вклад от стэкинг-взаимодействий. Так что уверенность в определяющей роли спаривания оснований основывалась не на твердом знании, а на знаменитом принципе, известном как «бритва Оккамы» (мы уже упоминали этот принцип в главе 4), т. е. казавшееся простейшим объяснение данных по плавлению ДНК принималось за истину.

Разделить вклады в стабильность двойной спирали от спаривания оснований и от стэкинг-взаимодействий удалось в моей группе в Бостонском университете в 2004–2006 годах. Эта работа была выполнена моим тогдашним постдоком, выпускницей МФТИ, защитившей диссертацию в Университете Торонто, Катей Протозановой и моим аспирантом Петей Яковчуком.

Идея работы возникла совершенно случайно, в ходе изучения коротких синтетических молекул ДНК, содержащих однонитевой разрыв («ник»). Мы обратили внимание на то, что такие молекулы движутся в геле при электрофорезе слегка медленнее, чем молекулы без разрыва. Оказалось, что причина в том, что молекулы с ником часть времени проводят в состоянии стэкинга, т. е. движутся так же, как и молекулы без разрыва, а часть времени проводят в состоянии разрушенного стэкинг-взаимодействия, как проиллюстрировано на рис. 40, и движутся в геле медленнее. Соотношение этих двух состояний должно экспоненциально зависеть от энергии стэкинга, согласно известному распределению Больцмана (точнее, речь идет не об энергии как таковой, а о свободной энергии). Таким образом, приготовив 16 синтетических молекул, отличающихся только двумя парами оснований слева и справа от места ника, мы определили энергию стэкинг-взаимодействий для всех 16 контактов. Важным инструментом, который мы при этом использовали, были специальные ферменты – никазы, способные совершенно точно наносить ник в определенном месте двухнитевой ДНК. Собственно, в ходе изучения работы никаз мы и наткнулись на эффект замедленного движения молекул с ником в геле.