Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века - [41]

Но вернемся к приобретенному иммунитету у бактерий. Как же его удалось обнаружить? Это открытие – прямое следствие успехов в области секвенирования геномов. Первые 10 лет после того, как Фредерик Сенгер изобрел свой метод секвенирования ДНК, дело продвигалось очень медленно. Как уже отмечалось в главе 5, всерьез эра секвенирования геномов началась после изобретения метода ПЦР в середине 1980-х годов, позволившего получать неограниченное количество копий выбранного исследователем участка ДНК (см. главу 10), и после широкого развития Интернета. К концу 1980-х годов даже геном кишечной палочки не был еще расшифрован и исследователи секвенировали отдельные участки этого генома. В 1987–1989 годах группа японских ученых из университета Осаки во главе с Атсуо Наката сообщила в специализированном микробиологическом журнале об обнаружении очень странного участка в геноме кишечной палочки. Он состоял из повторяющейся 14 раз идентичной последовательности из 29 нуклеотидов, причем эти повторы были отделены друг от друга промежуточными последовательностями из 32–33 нуклеотидов, не имеющими между собой ничего общего (рис. 24). Авторы не высказали никакой гипотезы, что бы это могло значить, и их статьи не привлекли ничьего внимания.

Спустя более 10 лет этими странными повторами заинтересовался испанский микробиолог Франциско Мохика. К началу 2000-х годов геномная база данных пополнилась множеством геномов бактерий и их вирусов. Мохика с соавторами обнаружил, что очень у многих бактерий наблюдаются участки, похожие на те, что были впервые описаны Накатой. Они получили длинное и неуклюжее название, которое сокращается как КРИСПР. Но самое главное, Мохика сравнил последовательности неповторяющихся промежутков между повторами с последовательностью различных вирусов и плазмид и обнаружил, что часто последовательности промежутков заимствованы из последовательностей ДНК фагов или плазмид, как раз тех, которые паразитируют на данной бактерии. При этом фаги, чьи участки перенесены в виде промежутков в кассету КРИСПР, не могут заражать бактерию. В своей статье 2005 года Мохика впервые предположил, что кассеты КРИСПР как-то связаны с иммунитетом у бактерий против чужой ДНК.

Рис. 24. Повторы, обнаруженные Атсуо Накатой с сотрудниками в геноме кишечной палочки. Ясно видно, что последовательность из 29 нуклеотидов (подчеркнуто) строго повторяется 14 раз, в то время как между промежуточными последовательностями, содержащими от 32 до 33 нуклеотидов, нет ничего общего

Это было поворотным моментом. К изучению системы КРИСПР подключился крупнейший американский биоинформатик российского происхождения Евгений Кунин, который углубил и расширил анализ последовательностей. Были выявлены кодирующие белки гены, участвующие в КРИСПР, получившие название «кас». Большой вклад в изучение проблемы внес российско-американский микробиолог Константин Северинов. Затем подоспели молекулярные биологи, которые довольно быстро разобрались в деталях того, как осуществляется иммунная реакция.

А происходит следующее (рис. 25). Вся кассета КРИСПР транскрибируется. Получившаяся РНК нарезается на куски, каждый из которых содержит один повтор и один промежуток. Такая небольшая молекула РНК, содержащая около 60 нуклеотидов, обозначается как крРНК. Ген кас экспрессирует кас-белок, который связывается с крРНК и начинает внимательно обследовать двунитевую ДНК в клетке. Белок локально раскрывает двойную спираль и примеряет к раскрытому участку крРНК. Когда происходит комплементарная гибридизация между крРНК и одной из цепей ДНК, кас-белок режет обе цепи ДНК, создавая двунитевой разрыв двойной спирали. Такой разрыв ведет к деградации ДНК в бактериальной клетке. Вторгшаяся в клетку плазмидная или фаговая ДНК обезврежена.

Почему же комплекс крРНК с кас-белком не набрасывается на саму кассету КРИСПР и не производит разрыв геномной ДНК бактерии? Для этого существует специальная, очень короткая последовательность, которая присутствует в ДНК фага или плазмиды и узнается кас-белком, но которая отсутствует в кассете КРИСПР. В отсутствие этой последовательности кас-белок не работает.

Таким оказался механизм приобретенного иммунного ответа бактерий. Да, остается только признать: в эклектическом буйстве жизни, с которым нам приходится иметь дело, нашлось место и Ламарку. Но громадный интерес, который привлекает к себе обнаруженный у бактерий иммунитет, связан не с частичной реабилитацией ламаркизма, а с практическими приложениями системы КРИСПР-кас в области редактирования генома в живой эукариотической клетке, о чем речь пойдет в главе 11.

Рис. 25. Механизм приобретенного иммунитета у бактерий (КРИСПР). КРИСПР-кассета состоит из повторов (белые участки) и промежутков 1, 2, 3,4… n. В случае кишечной палочки n = 13 (см. рис. 24). За КРИСПР-кассетой следуют гены, кодирующие кас-белки. Вся кассета транскрибируется и затем нарезается на отдельные крРНК, каждая из которых несет только одну промежуточную последовательность. Кас-белок связывает одну из крРНК, локально раскрывает двойную спираль вторгшейся ДНК, и когда происходит гибридизация между крРНК и участком вторгшейся ДНК, кас-белок наносит два однонитевых разрыва в обеих цепях раскрытой области двойной спирали: инфекция блокирована