Размышления и споры о вирусах - [24]
Рис. 4
Итак, первичная, грубая, но необходимая для последующей работы очистка и концентрация содержащего вирус материала проведена. Но это только начало пути, по которому можно прийти к высоко очищенной взвеси вирионов, при электронной микроскопии она выглядит так, как показано на рисунке.
Препарат такой чистоты, как на рисунке, путем адсорбции — элюции с эритроцитов не получишь. Для этого нужны другие методики, и главные из них — ультрацентрифугирование и хроматография.
Приставка ультра (от латинского сверх, за пределом) встречается в нашей речи, да и в этой книге достаточно часто. Ультрамодная одежда, ультрасовременная техника... Во всех этих случаях, собственно, как и в термине ультрацентрифугирование, больше абстрактного, нежели конкретного содержания. А если говорить именно конкретно, о вирусах и молекулярной биологии, надо понимать, что метод заключается все же в центрифугировании, то есть во вращении пробы вокруг какой-то оси, но со скоростью значительно превышающей средние, обычные показатели.
Для чего нужно вращать пробу? При вращении возникают две силы: центростремительная и центробежная. В принципе они равны, но действуют на разные объекты: первая — на связь, тело удерживающую, вторая — непосредственно на тело. Следовательно, если изготовить связь достаточно прочную, можно получить центробежную практически в чистом виде. А это очень важно, ибо в таком случае величина силы может быть огромной.
Формула центробежной силы mv>2/R, где m — масса тела, v — его скорость, R — радиус кривизны траектории. Уже при беглом взгляде на формулу понятно, благодаря чему происходят очистка и концентрация вируса. Ведь если раскручивать смесь, состоящую из материальных частиц разной массы, то более тяжелые приобретут большую центробежную силу и за одинаковое время успеют убежать от центра дальше тех, которые полегче.
При центрифугировании (любом, и ультра и не ультра) вируссодержащая жидкость расслаивается. Что-то выпадает в осадок, что-то оказывается около дна, что-то в середине центрифужной пробирки или стакана. Правда, при замедлении вращения после выключения центрифуги и последующих манипуляциях эти слои могут снова в какой-то степени перемешаться из-за броуновского (теплового) движения. Чтобы этого не произошло или, по крайней мере, чтобы смешалось как можно меньше, ученые идут на дополнительные меры — охлаждают смесь и помещают вируссодержащий материал в какие-либо вязкие растворы различной концентрации. Растворы имеют разную плотность (градиент плотности), и тоже располагаются слоями, в один из которых и "загоняют" или ловят вирус. Это очень красивое зрелище — зона опалесценции, видимая даже невооруженным глазом, из-за того что многие миллиарды вирионов собраны в ограниченном объеме.
Чтобы больше не возвращаться к ультрацентрифугированию, скажем еще, что этот же метод используется и для изучения внутренней структуры вирионов. Помещая совсем уже очищенный вирус в жидкость с разным градиентом плотности и раскручивая до ультраскоростей, можно разорвать вирион на части и сконцентрировать обломки в том или ином слое.
Ультрацентрифуга — очень сложная машина, требующая особых условий установки, охлаждения трущихся деталей и т. д. И хотя в ряде случаев без таких аппаратов не обойтись, очень часто оказывается возможным чистить и концентрировать вирусы с помощью бесшумного, безопасного и малоэнергоемкого метода хроматографии.
Хроматография основана совсем на другом принципе. Вирионы избирательно сорбируются, но не на эритроцитах, а на особых пористых веществах, а потом элюируют оттуда в солевые растворы. Таким путем получена, например, сверхчистая гриппозная вакцина учеными Ленинградского научно-исследовательского института микробиологии и эпидемиологии имени Л. Пастера и биофизиками Ленинградского политехнического института имени М. И. Калинина. В этом случае для хроматографической очистки используют так называемое широкопористое стекло.
Нет предела совершенству! Можно и так и эдак чистить вирус, доводя эту процедуру до получения взвеси одних только вирионов, практически без всяких примесей (кстати, советская хроматографическая вакцина относится к категории именно таких препаратов, недаром ее называют сверхчистой!), но это всего лишь начало молекулярной биологии вирусов. Вирусология начинается с накопления вирусной биомассы, молекулярная вирусология — с ее очистки. Впрочем, для такого дела, как получение вакцин, эта процедура является финальной — недаром же говорят: "центрифужная вакцина", "хроматографическая вакцина"...
Если очистка и концентрация вирусной взвеси — начало, то что же является продолжением? Это, конечно, зависит от цели работы, но так или иначе сводится к исследованию отдельных компонентов вириона, главным образом белков и нуклеиновых кислот.
Чтобы выделить какой-то компонент вириона, его надо разорвать, разрезать, то есть каким-то образом нарушить целостность и обеспечить возможность разным частям его путешествовать по самостоятельным маршрутам. Для этого используют несколько различных приемов, но суть их одна: дезинтегрировать (разрушить) вирусную частицу, разделить белковые компоненты и нуклеиновую кислоту и порознь изучить их. Часто прибегают к электрофорезу в своеобразном студнеобразном веществе, так называемом полиакриламидном геле (ПААГ). Электрофорез — разделение частиц исследуемого вещества по скорости их продвижения в этом геле при пропускании электрического тока. В зависимости от массы и заряда разные частички вещества пройдут в геле разное расстояние. А если вещество (белок или нуклеиновую кислоту) покрасить или пометить радиоактивными изотопами, то в полоске геля отчетливо можно будет обнаружить полосы, представляющие скопления однотипных молекул. Так выявляются отдельные
