Кризис аграрной цивилизации и генетически модифицированные организмы - [48]

Одна из стратегий, используемых некоторыми аэробными микроорганизмами для выживания в условиях недостатка кислорода, состоит в синтезе гемоглобинподобного продукта, способного аккумулировать кислород и доставлять его в клетки. Например, аэробная бактерия Vitreoscilla sp. синтезирует гомодимерный гемсодержащий белок, функционально подобный эукариотическому гемоглобину. Ген «гемоглобина» Vitreoscilla был выделен, встроен в плазмидный вектор Streptomyces и введен в клетки этого микроорганизма. После его экспрессии на долю гемоглобина Vitreoscilla приходилось примерно 0,1% всех клеточных белков S.coelicoior даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla, а не промотора Streptomyces. Трансформированные клетки S.coelicoior, растущие при низком содержании растворенного кислорода (примерно 5% от насыщающей концентрации), синтезировали в 10 раз больше актинородина на 1 г сухой клеточной массы и имели большую скорость роста, чем нетранс формированные. Этот подход можно использовать и для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих в условиях недостатка кислорода.

Исходным материалом при химическом синтезе некоторых цефалоспоринов — антибиотиков, обладающих незначительным побочным эффектом и активных в отношении множества бактерий, — является 7-аминоцефалоспорановая кислота (7АСА), которая в свою очередь синтезируется из антибиотика цефалоспорина С. К сожалению, природных микроорганизмов, способных синтезировать 7АСА, до сих пор не выявлено.

Новый   путь   биосинтеза   7АСА   был   сконструирован включением специфических генов в плазмиду гриба Acremonium chrysogenum, который обычно синтезирует только цефалоспорин-С. Один из этих генов был представлен кДНК гриба Fusarium solani, кодирующей оксидазу D-аминокислот, а другой происходил из геномной ДНК Pseudomonas diminuta и кодировал цефалоспоринацилазу. В плазмиде гены находились под контролем промотора A.chrysogenum. На первом этапе нового биосинтетического пути цефалоспорин-С превращается в 7-р-(5-карбокси-5-оксопентанамид) цефалоспорановую кислоту (кето-АО-7АСА) при помощи оксидазы аминокислот. Часть этого продукта, вступая в реакцию с пероксидом водорода, одним из побочных продуктов, превращается в 7-бета-(4-карбоксибутанамид)-цефалоспорановую кислоту (GL-7ACA). И цефалоспорин-С, и кето-А0-7АСА, и GL-7ACA могут подвергаться гидролизу цефалоспоринацилазой с образованием 7АСА, однако только 5% цефалоспорина-С напрямую гидролизуется до 7АСА. Следовательно, для образования 7АСА с высоким выходом необходимы оба фермента.

Интерфероны

В конце 70-х — начале 80-х г.г. XX века ДНК-технология впервые стала привлекать к себе внимание общественности и крупных инвесторов. Одним из перспективных биотехнологических продуктов был интерферон, на который в то время возлагали надежды как на чудодейственное средство против множества вирусных заболеваний и рака. О выделении кДНК интерферона человека и его последующей экспрессии в Escherichia coll сообщали все заинтересованные издания мира.

Для выделения генов или белков человека используют разные подходы. Обычно выделяют нужный белок и определяют аминокислотную последовательность соответствующего участка молекулы. Исходя из этого, находят кодирующую его нуклеотидную последовательность, синтезируют соответствующий олигонуклеотид и используют его в качестве гибридизационного зонда для выделения нужного гена или кДНК из геномных или кДНК-библиотек. Другой подход состоит в выработке антител к очищенному белку и использовании их для скрининга библиотек, в которых происходит экспрессия определенных генов. Для белков человека, синтезируемых преимущественно в какой-то одной ткани, кДНК-библиотека, полученная на основе мРНК, выделенной из этой ткани, будет обогащена последовательностью ДНК-мишени. Например, основным белком, синтезируемым клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, является инсулин, и 70% мРНК, выделенных из этих клеток, кодируют именно его.

Однако принцип обогащения кДНК неприменим для тех белков человека, количество которых очень мало или место синтеза которых неизвестно. В этом случае могут понадобиться другие экспериментальные подходы. Например, интерфероны (ИФ) человека, включающие альфа, бета- и гамма-интерфероны, — это природные белки, каждый из которых может найти свое терапевтическое применение. Первый ген интерферона был выделен в начале 80-х г.г. XX века. С тех пор было обнаружено несколько разных интерферонов. Полипептид, обладающий действием лейкоцитарного интерферона человека, синтезирован в E.coli.

Некоторые особенности интерферона сделали выделение его кДНК особенно сложным. Во-первых, несмотря на то что интерферон был очищен более чем в 80 ООО раз, его удавалось получать лишь в очень небольших количествах, т.к. в то время не была известна его точная молекулярная масса. Во-вторых, в отличие от многих других белков, интерферон не обладает легко идентифицируемой химической или биологической активностью: ее оценивали только по снижению цитопатического действия вируса животных на культуру клеток, а это сложный и длительный процесс. В-третьих, в отличие от инсулина, было неизвестно, есть ли клетки человека, способные вырабатывать интерферон в достаточно больших количествах, т.е. существует ли источник мРНК интерферона. Несмотря на все эти трудности, в конце концов была выделена и охарактеризована кДНК, кодирующая интерферон. При выделении их кДНК пришлось разработать специальный подход, позволяющий преодолеть трудности, связанные с недостаточным содержанием соответствующих мРНК и белков. Теперь такая процедура выделения ДНК обычна и стандартна и для интерферонов состоит в следующем.