Кризис аграрной цивилизации и генетически модифицированные организмы - [26]

Таким образом, вносимая генетическая конструкция (вставка или кассета экспрессии) — это группа функционально связанных участков ДНК, состоящая из высокоактивного промотора, непосредственно за которым располагаются соответствующий целевой ген и терминатор транскрипции. После получения вектора и вставки начинается процесс конструирования рекомбинантной ДНК. Полученные молекулы ДНК вводят в бактериальные клетки для клонирования, что приводит к накоплению рекомбинантной ДНК. Эффективное увеличение количества ее копий возможно лишь при обеспечении оптимальных условий существования вектора, использующего метаболиты, ферменты и другие белки клетки-хозяина, а также ее аппарат белкового синтеза, поэтому основной инструмент молекулярного клонирования — совместимая комбинация хозяина и вектора. Наиболее широко применяются такие сочетания, когда в роли хозяина выступает штамм E.coli, а в роли вектора — его плазмида. Проникновение вектора в живые клетки E.coli проходит наиболее эффективно при условии повышенной проницаемости клеточных мембран, обусловленной, например, их локальным разрушением. Нарушение их целостности достигается либо воздействием электрического тока — электропорацией, либо посредством обработки клеток определенными химическими веществами, после чего перенос вектора происходит в течение нескольких минут. Векторы обычно содержат маркерные гены, благодаря которым осуществляется отбор клеток с измененным генотипом. Например, клетки, чувствительные к определенному антибиотику или токсину, можно использовать в комбинации с векторами, содержащими гены устойчивости к этим агентам. Выращивая микроорганизмы в условиях, при которых проявляется зависимость от маркерных генов, можно отобрать и размножить клетки, несущие требуемый генетический материал.

Методология прикладного использования ДНК-технологий

ДНК-технология или генная (генетическая) инженерия — направление исследований в генетике, в рамках которого разрабатывают приемы, позволяющие по заранее намеченному плану перестраивать геном организмов (совокупность генетических элементов организма), изменяя в нем генетическую информацию. С помощью рестриктаз и лигаз получают перестроенные (химерные) молекулы ДНК. Их еще называют рекомбинантными — полученными в результате объединения in vitro в природе никогда вместе не существующих фрагментов ДНК (например, ДНК бактерии и растения). Живую систему для размножения рекомбинантных молекул выбирают среди бактерий. Получение рекомбинантных ДНК в количестве, необходимом для проведения генетической модификации, позволяет перейти непосредственно к ключевому этапу получения ГМ культур: трансформации растительных клеток. В идеале трансформационная система должна отвечать определенным условиям: быть простой, эффективной и дешевой. Однако, несмотря на сравнительно широкий выбор методических приемов, всем требованиям не соответствует ни один из них. Тем не менее в настоящее время для производства трансгенных культур в промышленных масштабах в основном применяются два способа модификации растительного генома — агробактериальный (то, как это делается в природе, см. выше) и баллистический, баллистическая трансформация растительных клеток (еще называемый микробомбардировкой, методом ускорения частиц, биолистикой — термин, произошедший от объединения слов «биология» и «баллистика») состоит в «обстреле» растительных клеток золотыми или вольфрамовыми частицами, которые играют роль переносчика рекомбинантной ДНК. В сущности, микрочастицы могут быть из любого химически инертного металла с достаточно высокой молекулярной массой (золото, вольфрам, палладий, родий, платина, индий), чтобы не образовывать с ДНК металлорганических комплексов и обладать достаточно высокой кинетической энергией для эффективной пенетрации клеточной стенки. Частицам размером 1,5-3 микрона, конъюгированным с ДНК, придается скорость 300-600 м/сек посредством электрического разряда или декомпрессии в направлении клеток-мишеней, подлежащих трансформации. Несмотря на то, что эффективность этого способа невысока (не более 15%), баллистический метод — весьма распространенный прием трансформации однодольных растений.

В последнее время разработан и успешно применен комбинированный метод трансформации, названный агролистическим. Он основан на объединении баллистического и агробактериального способов и заключается во введении в геном растения каким-либо физическим методом (в большинстве случаев баллистическим) чужеродной ДНК, включающей агробактериальные гены.

Конечный этап — получение трансгенных растений, как правило, преодолевается легче, чем предыдущие процедуры. Благодаря тому, что многие клетки растений тотипотентны, то есть из любой единичной клетки может вырасти целое плодоносящее растение, трансгенные растения получают из трансформированных клеток.

Культивирование растений с модифицированным геномом включает несколько серий пересевов на селективных средах. Длительность регенерации трансформированных растений достигает нескольких месяцев, причем все это время они находятся в среде с высокими концентрациями селективных веществ. Как правило, применяются маркерные гены двух основных типов — селективные и репортерные. Селективные придают растениям устойчивость к антибиотикам или гербицидам, позволяя трансформированным растениям расти в условиях действия селективных агентов. Репортерные гены детерминируют синтез нейтральных для клеток белков, наличие которых в тканях может быть легко установлено. При получении генетически модифицированного растения, устойчивого к пестицидам, ген устойчивости выступает как в роли целевого, так и селективного гена.