Компьютерра, 2006 № 33 (653) - [15]
Группе из Гарварда удалось добиться пространственного разрешения около 20 нм, что на порядок меньше дифракционного ограничения. И это далеко не предел. Ученые использовали специальные флюорофоры, чьи молекулы можно быстро переключать между возбужденным и «потушенным» состоянием, облучая их импульсами света с разной длиной волны. Эти переключения значительно ускоряют измерения, поскольку уже не нужно ждать, пока все возбужденные молекулы «потухнут» сами. Ученые присоединили флюорофоры к антителам, которые можно подобрать так, чтобы они, в свою очередь, присоединялись к различным биомолекулам. Для исследования одного образца можно использовать целый набор флюорофоров, работающих на разных длинах волн. Каждый флюорофор будет реагировать на свой лазер и присоединяться к своим молекулам или их определенным участкам. Сложив все эти изображения, можно получить цветное изображение спирали ДНК или белковой нити. Исследование одного образца занимает несколько минут, а в ближайшем будущем авторы метода обещают научиться следить за путешествиями молекул внутри клетки даже в реальном времени.
Вторая группа использовала возбуждаемые лазером люминесцирующие белки. Ее метод позволил добиться лучшего пространственного разрешения в пределах 2-25 нм. Однако здесь за одну секунду удается сделать лишь один-два снимка, и для получения полного изображения с высоким разрешением требуется около двенадцати часов. Для демонстрации возможностей своей методики ученые получили изображения определенных белков в лизосомах и митохондриях, а также ряд других интересных фотографий живой клетки.
Любопытно, что два основных автора PALM-микроскопии Харальд Хесс (Harald Hess) и Эрик Бетциг (Eric Betzig) построили первый прототип своего нового микроскопа еще в сентябре прошлого года в гостиной Хесса. Будучи в то время без работы, эти известные в своей области ученые сложились по 25 тысяч долларов, стряхнули пыль со старого оборудования, списанного в лаборатории Белла, и создали новый метод. Вскоре они получили финансовую поддержку и достойные должности в институте Хьюза.
Разумеется, обе научные группы пока лишь в самом начале пути. Пройдет еще немало времени, прежде чем новые методы станут привычным инструментом биологов. Но эти разработки способны навести долгожданный мост между молекулярной и клеточной биологией, и возможно, что открытия вскоре посыплются как из рога изобилия.
Разработчики новейших методик стараются сблизить два полюса биомикроскопии, разделенные по разрешающей способности пропастью шириной более чем в два порядка: оптическую микроскопию, позволяющую исследовать не только мертвые, но и живые клетки, и электронную микроскопию, изучающую клетки заведомо убитые, но зато с завидной точностью. Граница применимости «прижизненной» микроскопии понятна: с длины волны ниже 400 нм начинается губительный для клеток ультрафиолет.
Что же до электронной микроскопии, то именно благодаря достигаемому ею разрешению в несколько ангстрем удалось составить подробные карты «внутриклеточного ландшафта» и воочию, без домыслов, увидеть строение клеточного ядра, а также митохондрий, рибосом и других клеточных органелл. Но понятно, что на острие электронного пучка, разогнанного в вакууме полем напряженностью в десятки киловольт, живьем ничего не разглядишь. Электронная микроскопия знает лишь один экзотический пример, когда твердейший хитиновый покров членистоногих сканируют без всякой предварительной подготовки. А так - нежную и трепетную живую ткань приходится фиксировать альдегидами и четырехокисью осмия, обезвоживать, заливать полимеризующимися материалами, пропитывать специальными «электронными» красителями и готовить тончайшие срезы «на просвет».
А биология сегодняшнего дня предъявляет все больший спрос на исследование клеток и тканей непосредственно в процессе их жизнедеятельности. Чтобы сохранить «щадящий» характер световой микроскопии и при этом повысить разрешающую способность, исследователи идут на компромисс - скажем, в обмен на вожделенную точность смиряются с необходимостью многократных повторных измерений. Компромисс, однако, всегда штука непростая. Обратим внимание: схема, при которой процесс получения одной-единственной сверхточной картинки растягивается на минуты и даже часы, может безотказно работать только на неподвижном объекте, отдельные части которого не расползутся в разные стороны прямо по ходу «сложносочиненного» замера. Собственно, все сенсационные результаты новейших методик высокого разрешения и были получены на специально фиксированных объектах. Но ведь поставленная сверхзадача - исследование функционирующей клетки со всеми ее внутриклеточными транспортными потоками, сократительными белками и т. п. И мы не можем, подобно пляжному фотографу, скомандовать ей «замрите, снимаю».
Судя по оптимистичному тону профессора Сяовэя Чжуана (Xiaowei Zhuang), уверенного в возможности ускорения процедуры STORM-микроскопии вплоть до исследования живых клеток с молекулярным разрешением в реальном масштабе времени, разработчики надеются преодолеть это концептуальное противоречие. Но, может быть, ближе к истине профессор Дженнифер Липпинкотт-Шварц (Jennifer Lippincott-Schwartz), видящая будущее новых методик в их сочетании с электронной микроскопией: «Соотнося результаты PALM-микроскопии с электронномикроскопической картиной, можно понять, как отдельные активные молекулы распределены по тонким субклеточным структурам».
