История биологии с начала XX века до наших дней - [236]

Огромное значение для становления молекулярной биологии имела расшифровка механизмов репликации ДНК и транскрипции (см главу 24).

Биосинтез белка.

Важный сдвиг в решении проблемы биосинтеза белка связан с успехами в изучении нуклеиновых кислот. В 1941 г. Т. Касперсон (Швеция) и в 1942 г. Ж. Браше (Бельгия) обратили внимание на то, что в тканях с активным белковым синтезом содержится повышенное количество РНК. Они пришли к выводу, что рибонуклеиновые кислоты играют определяющую роль в синтезе белка. В 1953 г. Е. Гейл и Д. Фокс, как будто, получили прямые доказательства непосредственного участия РНК в биосинтезе белка: по их данным, рибонуклеаза существенно подавляла включение аминокислот в лизатах бактериальных клеток. Аналогичные данные были получены В. Олфри, М. Дели и А. Мирским (1953) на гомогенатах печени. Позднее Э. Гейл отказался от высказанной им правильной идеи о ведущей роли РНК в белковом синтезе, ошибочно считая, что активация белкового синтеза в бесклеточной системе происходила под влиянием какого-то другого вещества неизвестной природы. В 1954 г. П. Замечник, Д. Литлфилд, Р. Б. Хесин-Лурье и другие обнаружили, что наиболее активное включение аминокислот происходит в богатых РНК фракциях субклеточных частиц — микросом. П. Замечник и Э. Келлер (1953–1954) обнаружили, что включение аминокислот заметно усиливалось в присутствии надосадочной фракции в условиях регенерации АТФ. П. Сикевиц (1952) и М. Хогланд (1956) выделили из надосадочной жидкости белковую фракцию (pH 5 фракция), которая была ответственной за резкое стимулирование включения аминокислот в микросомах. Наряду с белками в надосадочной жидкости был обнаружен особый класс низкомолекулярных РНК, которые теперь называют транспортными РНК (тРНК). В 1958 г. Хогланд и Замечник, а также П. Берг, Р. Свит и Ф. Аллен и многие другие исследователи обнаружили, что для активации каждой аминокислоты необходим свой особый фермент, АТФ и специфическая тРНК. Стало ясно, что тРНК выполняют исключительно функцию адаптеров, т. е. приспособлений, которые находят на нуклеиновой матрице (иРНК) место соответствующей аминокислоте в формирующейся белковой молекуле. Эти исследования полностью подтвердили адапторную гипотезу Ф. Крика (1957), предусматривавшую существование в клетке полинуклеотидных адапторов, необходимых для правильного расположения аминокислотных остатков синтезирующегося белка на нуклеиновой матрице. Уже много позднее французский ученый Ф. Шапвиль (1962) в лаборатории Ф. Липмана (Нобелевская премия, 1953) в США весьма остроумно и однозначно показал, что местоположение аминокислоты в синтезирующейся белковой молекуле полностью определяется той специфической тРНК, к которой она присоединена. Адапторная гипотеза Крика была развита в работах Хогланда и Замечника.

К 1958 г. стали известны следующие основные этапы белкового синтеза: 1) активация аминокислоты специфическим ферментом из «pH 5 фракции» в присутствии АТФ с образованием аминоациладенилата; 2) присоединение активированной аминокислоты к специфической тРНК с высвобождением аденоаиимонофосфата (АМФ); 3) связывание аминоацил-тРИК (тРНК, нагруженная аминокислотой) с микросомами и включение аминокислот в белок с высвобождением тРНК. Хогланд (1958) отметил, что на последнем этапе белкового синтеза необходим гуанозинтри-фосфат (ГТФ).

Транспортные РНК и синтез гена.

После обнаружения тРНК начались активные поиски их фракционирования и определения нуклеотидной последовательности. Наибольших успехов добился американский биохимик Р. Холли. В 1965 г. он установил структуру аланиновой тРНК из дрожжей. При помощи рибонуклеаз (гуаниловая РНК-аза и панкреатическая РНК-аза) Холли разделил молекулу нуклеиновой кислоты на несколько фрагментов, определил в каждом из них по отдельности нуклеотидную последовательность и затем реконструировал последовательность всей молекулы аланиновой тРНК. Этот путь анализа нуклеотидной последовательности получил название блочного метода. Заслуга Холли состояла главным образом в том, что он научился разделять молекулу РНК не только на мелкие куски, как это делали многие и до него, но и на крупные фрагменты (четвертинки и половинки). Это и дало ему возможность правильно собрать отдельные маленькие куски воедино и тем самым воссоздать полную нуклеотидную последовательность всей молекулы тРНК (Нобелевская премия, 1968).

Этот прием сразу же был принят на вооружение во многих лабораториях мира. В течение последующих двух лет в СССР и за рубежом была расшифрована первичная структура сразу нескольких тРНК. А.А. Баев (1967) и сотрудники впервые установили последовательность нуклеотидов в дрожжевой валиновой тРНК. К настоящему времени изучено уже более десятка различных индивидуальных тРНК. Своеобразный рекорд в определении нуклеотидной последовательности установлен в Кембридже Ф. Сейгером и Г. Браунли. Эти исследователи разработали удивительно изящный метод разделения олигонуклеотидов и установили последовательность так называемой 5 S (рибосомной) РНК из клеток кишечной палочки (1968). Эта РНК состоит из 120 нуклеотидных остатков и в отличие от тРНК не содержит дополнительных минорных оснований, которые заметно облегчают анализ нуклеотидной последовательности, служа уникальными ориентирами отдельных фрагментов молекулы. В настоящее время благодаря использованию метода Сенгера и Браунли успешно продвигается работа по изучению последовательности длинных рибосомных РНК и некоторых вирусных РНК в лаборатории Ж. Эбеля (Франция) и других исследователей.