История биологии с начала XX века до наших дней - [131]
Широкое и полноценное использование культивируемых вне организма клеток для цитологических исследований стало возможным благодаря введению в 50-х годах метода клеточных культур на жидких питательных средах.
Росс Гренвил Гаррисон. 1870–1959.
Клеточные культуры представляют собой популяции самостоятельных клеток, которые только вторично и далеко не всегда устанавливают между собой протоплазматические связи, однако оказывают взаимное гуморальное влияние. Клетки однослойных культур служат превосходным объектом и для проведения микроскопических исследований с использованием замедленной (цейтрафферной) микрокиносъемки. С помощью микрокиносъемки изучены движение, деление, фагоцитоз и многие другие нормальные и патологические процессы в клетках.
Наряду с применением клеточных культур в цитологии, особенно в последние годы, широко используются культуры органов, клетки которых входят в состав целых эмбриональных зачатков или фрагментов органов взрослых животных (А. Тома, 1970).
Существенное значение для развития метода прижизненного изучения клетки имело усовершенствование оптических средств исследования. К их числу относится прежде всего темнопольная микроскопия («ультрамикроскопия»), практическое применение которой стало возможно после изобретения в 1910 г. Г. Зидентопфом кардиоид-конденсора. Важные цитологические наблюдения с использованием темнопольной методики сделал Н.М. Гайдуков (1916).
В 40-50-х годах широкое распространение получила фазово-контрастная микроскопия. Ее разновидностью явилось аноптральное устройство, схему которого разработали А. Вильска (1953) и М.А. Пешков.
Прижизненному изучению клетки содействовало также развитие люминесцентной (флуоресцентной) микроскопии. В основе этого метода лежит открытие А. Келером (1904) флуоресценции объектов в темном поле при освещении их ультрафиолетовыми лучами (УФ). Широкое применение в цитологии люминесцентного микроскопа, сконструированного Келером и Зидентопфом (1908), стало возможным после того, как М. Гайтингер разработал метод окраски биологических объектов флуорохромами — веществами, обладающими способностью светиться после их УФ-облучения. С помощью люминесцентной микроскопии получены ценные сведения о строении, обмене веществ и функционировании нормальных и патологически измененных клеток (раковых, после воздействия вирусов и т. д.).
Уоррен Льюис. 1870–1964.
Одно из наиболее важных направлений флуоресцентной микроскопии связано с применением метода флуоресцирующих антител, впервые предложенного в 1941–1942 гг. А. Кунсом и сотрудниками (1956) для выявления чужеродного антигена. Содержащиеся в сыворотке антитела связываются с флуорохромами. Меченные таким образом антитела соединяются с соответствующими антигенами и позволяют определить локализацию как бактериальных и вирусных антигенов, так и различных белков, вызывающих образование соответствующих антител. Метод флуоресцирующих антител позволил изучить локализацию и динамику накопления специфических белков, в частности ряда ферментов, появление белковых продуктов эмбриональной дифференцировки, топографию вируса и динамику его накопления в клетке, реакцию иммунокомпетентных клеток на проникновение в организм инфекции и т. д.
Основным методом изучения клетки в прижизненном состоянии стала микрургия, дающая возможность производить на клетках разнообразные операции. Разработка достаточно совершенной техники операций на клетках относится к началу XX в., когда был сконструирован микроманипулятор. Этот инструмент позволил извлекать из клетки отдельные органоиды (в частности, хромосомы), измерять электрические потенциалы с помощью микроэлектродов, вводить в клетку разнообразные вещества, бактерии, ядра и другие компоненты сходных или чужеродных клеток. Микроманипулятор был создан в самом начале XX в. одновременно С. Схоутеном (1901) в Нидерландах, М. Мак-Клендоном и М. Барбером (1901) в США. С.С. Чахотин (1959) использовал изобретенный им микрооператор (1912) для строго локализованного воздействия на клетку пучка УФ (лучевой микроукол). С помощью локального воздействия УФ удавалось нарушить двойное лучепреломление в ахроматическом веретене (клетки подсолнечника), повредить участки митотического аппарата (в клетках тритона) и т. д. Основные работы с микроманипулятором были выполнены во втором десятилетии XX в. американским исследователем Р. Чемберсом.
Извлечение ядра из амебы с помощью микроинструмента, по П. Фонбрюну. 1951.
Наряду со значительными успехами в изучении живой клетки XX в. ознаменовался крупными достижениями и в исследовании клетки фиксированной. Первостепенную роль здесь сыграли методы цитохимии (гистохимии).
Основной задачей цитохимии является выяснение химической природы клеточных структур и продуктов жизнедеятельности клетки, а также расшифровка происходящих в ней биохимических процессов. Цитохимические методы исследования дают возможность топографически изучить локализацию ряда химических веществ и процессов. Применение всех цитохимических реакций основано на природной или искусственно создаваемой окраске изучаемых веществ. Примером цитохимических реакций первого рода является изучение пигментов в клетке, а применение реакций второго рода основано на избирательной окраске некоторых внутриклеточных веществ (например, окраска нейтрального жира Суданом) или на выпадении в результате химической реакции нерастворимого осадка какого-либо вещества. Так, о наличии и локализации активности кислой фосфатазы судят по локализации осадка сернистого свинца в присутствии субстрата ферментативной реакции (β-глицерофосфата).
