Генетика человека с основами общей генетики - [31]
Ферменты бактериальной клетки могут модифицировать ДНК внедрившегося фага еще до того, как его атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приведет к лизису клетки, а все потомство такого фага будет содержать также модифицированную ДНК. Оно будет способно заражать другие бактерии с такой же системой репарации.
К 1977 г. А. Максамом, У. Гилбертом и Ф. Сэнджером (Gilbert W., 1981; Sanger F., 1981) были разработаны специальные методы определения нуклеотидных последовательностей ДНК, которые получили название секвенирование (от англ. sequence – последовательность). Эти методы сыграли судьбоносную роль в становлении геномики и генной инженерии. Методы секвенирования основаны на создании набора одноцепочечных фрагментов ДНК, оканчивающихся определенным нуклеотидом, для чего используются специфические рестриктазы. Разработаны разные методические подходы секвенирования и способы выделения набора фрагментов. В настоящее время высокий уровень технического оснащения сделал секвенирование достаточно рутинной лабораторной работой.
Синтез генов путем обратной транскрипции первоначально представлялся наиболее перспективным. Если известна хотя бы часть первичной структуры нужного белка, то можно синтезировать коллинеарную часть соответствующего гена. Такие участки получили название ДНК-зондов. Их применяют для поиска м-РНК, имеющей комплементарный им участок. Выделенную с помощью зонда м-РНК можно использовать для синтеза комплементарной ДНК (к-ДНК) путем обратной транскрипции. После синтеза одной цепи с помощью ДНК-полимеразы можно синтезировать вторую цепь.
Большим недостатком этого метода является отсутствие регуляторных элементов в синтезированных генах, необходимых для экспрессии. К тому же часто к-ДНК является упрощенной копией гена, поскольку содержит только его кодирующую часть, т. е. экзоны (без интронов).
7.2. Создание рекомбинантной ДНК
Для переноса необходимого генетического материала используются особые структуры, способные переносить чужеродную ДНК в клетку-реципиент – векторы. Еще в начале развития генной инженерии векторы получили название «молекулярное такси». В качестве векторов могут использоваться два вида структур, содержащих ДНК: плазмиды и вирусы. ДНК вектора разрезают теми же рестриктазами, которые использовались для экзогенной ДНК.
Рестриктазы, обычно используемые в генной инженерии, разрезают обе цепи ДНК в симметричных точках палиндромов – коротких участков ДНК, в которых запись нуклеотидов слева направо в одной цепи аналогична записи справа налево другой цепи. Так, первая рестриктаза, которая нашла широкое применение, EcoR1, узнает последовательность GAATTC. Участок цепи ДНК она всегда разрывает между точками G и А.
Поэтому фрагменты ДНК, полученные при помощи этой рестриктазы, всегда несут на своих концах одноцепочечные участки ААТТ и ТТАА, комплементарные друг другу. Такие участки получили название «липкие концы», поскольку они позволяют любые фрагменты ДНК, полученные при помощи одной рестриктазы, соединять друг с другом. Это свойство и используется для соединения полученной ДНК и ДНК вектора.
Каждая рестриктаза узнает свою специфичную последовательность. Некоторые рестриктазы дают «липкие концы», другие – «тупые концы», воздействуя на связи, расположенные точно друг против друга. «Тупые концы» можно превратить в «липкие», присоединив искусственно синтезированные последовательности, узнаваемые определенной рестриктазой, – линкеры. Они позволяют клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безотносительно к специфичности сайтов рестрикции. Иногда к «тупым концам» присоединяют (при помощи фермента терминальная трансфераза) комплементарные «хвосты» – поли (А) и поли (Т).
7.3. Введение рекомбинантной ДНК в клетку
К настоящему времени сконструировано множество типов векторов на основе разнообразных плазмид и вирусов.
Плазмиды являются основным материалом векторов. Геном плазмид представляет собой кольцевую ДНК и имеет систему контроля репликации, которая поддерживает их количество в бактериальной клетке на определенном уровне. Многие плазмиды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам.
На первых этапах генной инженерии применяли естественные плазмиды бактерий. Сейчас создают искусственные (рекомбинантные) плазмиды со стандартными свойствами. Они обычно содержат один сайт рестрикции к какой-либо одной рестриктазе, несут два гена устойчивости к разным антибиотикам и имеют ослабленный контроль репликации. Контроль репликации, свойственный природным плазмидам, ограничивает число плазмид в клетке. Обычно бактериальная клетка имеет 20–30 плазмид, но ослабленный контроль репликации позволяет накапливать в клетке более 1000 плазмид.
