Генетический детектив. От исследования рибосомы к Нобелевской премии - [66]

После моего возвращения нам несколько месяцев не удавалось добиться никакого прогресса. Однажды ко мне в кабинет зашла Хонг Джин, постдок, защитившая кандидатскую в йельской лаборатории Питера. Она была новичком в кристаллографии и спросила, как устроен процесс заморозки кристаллов. На самом деле процедура проста. Кристалл переносится в криопротектор – раствор с таким же составом, что и исходная среда, в которой кристалл выращивается с добавлением определенного соединения, действующего в качестве антифриза: это может быть глицерин, спирт или этиленгликоль. Но она сказала, что мы работаем не так. Когда я услышал от нее, чем же мы занимаемся на самом деле, внезапно осознал, почему же с новыми кристаллами ничего не получается.

Перенося кристаллы в криопротектор, мои лаборанты забывали добавить в раствор некоторые исходные ингредиенты, в частности магний. Разумеется, все мы знали, что магний важен не только для скрепления двух субъединиц рибосомы, но и для свертывания РНК. Неудивительно, что кристаллы отличались. Вероятно, изначально хорошие кристаллы меняли форму по мере того, как теряли магний перед замораживанием. Также становилось понятно, почему не происходит связывание с факторами терминации трансляции. Хотелось себя ударить за ошибку, которая стоила нам двух лет. Но теперь мы могли двигаться вперед.

Мы хотели разобраться, как рибосома «узнает», что пора остановиться. В конце кодирующей последовательности находится один из трех стоп-кодонов (UAA, UAG или UGA), каждый из которых не соответствует какой-либо аминокислоте, а сигнализирует, что достигнут конец последовательности. Когда один из этих стоп-кодонов входит в А-сайт рибосомы, он распознается факторами терминации трансляции, которые связываются с рибосомой и «отрезают» свежий белок от тРНК. У бактерий два таких фактора, именуемых RF1 и RF2. Вопрос был фундаментальным: как рибосома выпускает готовый белковый продукт?

Мы чуть не опоздали. Сабина написала нам, что на конференции в районе бухты Сан-Франциско представитель группы Гарри сообщил, что они расшифровали структуру рибосомы с RF1, распознающим стоп-кодоны UAA и UAG. Сотрудники Гарри отвергли ими же полученную кристаллическую форму, которую сами яростно защищали на конференции в Кейп-Коде, и просто воспроизвели нашу, но, избежав той ошибки, которую мы допускали при замораживании. Предполагаю, что это в конечном итоге был комплимент, но до сих пор обидно.

Мы сломя голову принялись за аналогичную задачу – добиться того же с RF2, распознающим UAA и UGA. Идея была такова: располагая двумя факторами терминации трансляции, определить, как они отличают три стоп-кодона от шестидесяти одного оставшегося, то есть тех, которые кодируют аминокислоты и распознаются тРНК.

Альберт, лучше всех нас разбиравшийся в кристаллографии 70S, возглавил эту работу. Ему помогала Хонг, указавшая мне на проблему. Как и прежде, в деле участвовала вся лаборатория. На этот раз к нам присоединились аспиранты Кай Нойбауэр и Ребекка Вурхис.

Кай приступил к проработке проблемы, весьма опосредованно связанной с основным путем трансляции: стал выяснять, как рибосомы выручаются специальной молекулой, когда застревают в дефективной мРНК, например, в такой, где не хватает стоп-кодона. Спокойный и серьезный молодой человек, студенческие годы проведший в Германии, был дипломатичен и всем нравился. Часто он выступал посредником, когда в лаборатории случались конфликты.

Ребекка приехала из Йеля, где училась под руководством Скотта Стробела (того самого, который проделал огромную работу, выясняя, как рибосома образует пептидную связь). Стробел сообщил мне, что Ребекка получала более лестные отзывы, чем многие его постдоки. Странно, что изначально она прибыла к нам для учебы по годичной магистерской программе, после чего собиралась вернуться в свой медицинский вуз в США. Тем более необычно, что она пришла к нам с собственным проектом по связыванию двух тРНК веществом, которое имитирует две аминокислоты с пептидной связью. Мы могли поймать рибосому прямо в момент образования пептидной связи, этот проект не удался. Несмотря на неудачу, Ребекка осталась на десять лет в LMB, а уже затем уехала в США, где получила штатную преподавательскую должность в Калтехе.

К счастью, журнал Science был заинтересован в публикации нашего «сюжета» о факторах терминации трансляции, и нам удалось составить вполне достойную статью о том, как RF2 связывается с рибосомой. На ту же тему параллельно поступили статьи из лаборатории Гарри.

Но к тому моменту сразу в нескольких лабораториях удалось воспроизвести кристаллы, открытые Марией. Так, допустив ошибку с магнием, мы проиграли наше почти двухгодичное лидерство, а работа с новыми кристаллами стала всеобщим достоянием.

Имевшиеся у нас кристаллы не годились для ответа на вопрос: доставляются ли тРНК к рибосоме, или тРНК и мРНК проникают через нее. На этих этапах процесс катализируется факторами ГТФазы EF-Tu и EF-G, которые гидролизируют ГТФ, тем самым обеспечивая ход рибосомной машины. Из таких кристаллов выступает белок L9, связывающийся с соседней рибосомой в кристалле, блокируя связь с любыми факторами ГТФазы. Мы оказались перед очередной преградой.