ДНК и её человек - [12]

ДНК-блот, или саузерн-блот, или саузерн-блоттинг, – метод выявления определенной нуклеотидной последовательности ДНК в образце. ДНК обрабатывают рестриктазами, получившиеся фрагменты разгоняют на электрофорезе. Затем накладывают на гель листок нитроцеллюлозной или нейлоновой мембраны и плотно прижимают. ДНК при этом отпечатывается на мембране и довольно прочно связывается с ней (мембрана заряжена положительно, а ДНК, как мы помним, отрицательно). Для окончательного закрепления мембрану сушат в вакууме, нагревают или освещают УФ-излучением. Потом ее опускают в раствор, содержащий зонд – однонитевую молекулу ДНК, комплементарную участку той последовательности, которая нас интересует. Зонд гибридизуется (связывается) с ДНК образца; двухцепочечные участки к тому моменту расплетаются – денатурируют, так что с этим проблем не возникает. Молекула-зонд каким-то образом помечена (содержит радиоактивный изотоп или к ней прицеплена молекула красителя), и в результате на мембране-блоте появится радиоактивная или окрашенная полоска – она соответствует фрагменту ДНК, который содержит участок, комплементарный зонду. Радиоактивную полоску мы можем увидеть таким же способом, как и полоски на геле после секвенирования, – приложив мембрану к рентгеновской пленке на некоторое время и затем проявив ее. Таким способом, например, можно прикинуть, сколько раз эта последовательность встречается в геноме. А можно вырезать соответствующую метке полоску из геля, выделить из нее ДНК (после блоттинга ее там осталось еще много, не вся ДНК связалась с мембраной) и исследовать дальше именно нужный фрагмент.

“Southern” в переводе с английского – “южный”, и вполне естественно, что основанный на аналогичном принципе метод определения мРНК в образце получил название “нозерн-блоттинг”, а метод определения специфических белков – “вестерн-блоттинг”, то есть северный и западный соответственно. Сам Эдвин Саузерн, по свидетельству того же Алека Джеффриса, никогда не называл свой метод отпечатков “саузерн-блоттингом”, а скромно говорил “перенос ДНК”.

В 1977 г. (статья Сенгера о секвенировании методом терминаторов только что опубликована) Джеффрис вернулся в Великобританию, в Лестерский университет, чтобы “поженить новые технологии, которыми пользовалась молекулярная биология, с генетикой человека”. По его словам, идея использовать эти технологии для поиска наследуемых индивидуальных вариаций в геноме появилась уже тогда. Через семь лет, в 1984 г., Алек Джеффрис открыл “метод отпечатков пальцев ДНК”, который часто называют более коротко, калькой с английского, “ДНК-фингерпринтинг” или “ДНК-фингерпринт”.

Очевидно, что в геномах у разных людей должны быть различия, но как найти эти крошечные индивидуальные различия среди миллиардов букв? Оказалось, для этого необязательно секвенировать весь геном. Можно использовать саузерн-блоттинг.

Алек Джеффрис одним из первых описал феномен полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (restriction fragment length polymorphism, RFLP). Два образца ДНК – допустим, взятые у двух разных людей – обрабатывают одной и той же рестриктазой, потом гибридизуют отпечатки на мембране с одним и тем же зондом и получают неодинаковые картинки, длины меченых фрагментов не совпадают. Почему так происходит?

Оказалось, у некоторых людей может отсутствовать тот или иной сайт рестрикции по причине замены одного нуклеотида, например GGGCCC у них превращается в GGТCCC. Рестриктаза теперь его не узнаёт – она сурова, как поисковик программы Word, и, в отличие от Google, не делает поправок на опечатки. Если обработать рестриктазой ДНК человека с такой мутацией, то вместо двух коротких фрагментов, как у большинства людей, у него получится один длинный. И та же картина может наблюдаться у потомков этого человека.

STR и момент “эврика!”

Казалось бы, вот он, путь к изучению человеческого разнообразия. Но путь, с учетом тогдашних технических возможностей, не слишком удобный. Таких однобуквенных замен в геноме человека очень много – около 10 млн у каждого из нас. (Правильнее называть их однонуклеотидными полиморфизмами – single nucleotide polymorphism, SNP, или просто снипы; запомним этот термин, нам с ним еще встречаться и встречаться!) Но невозможно угадать заранее, какой сайт рестрикции может быть испорчен нуклеотидной заменой у конкретного человека. “Их [SNP] трудно найти и проанализировать, и они не очень-то много говорят о разнообразии людей: ты или видишь отличие, или не видишь”, – говорил Джеффрис[14]. Современных специалистов по ДНК-идентификации снипы очень интересуют, но тогда – нужен был другой метод. Что-то другое в геноме человека, то, что есть у всех, но при этом достаточно разнообразно и может использоваться в качестве индивидуальных характеристик.

И такие участки в геноме существуют. Теперь, после изобретения Джеффриса, кажется, будто эволюция их специально разработала для нужд судебных экспертов! Тандемные повторы ДНК – короткие участки, которые повторяются много раз, как сказка про белого бычка; тандемными они называются потому, что идут друг за другом, “голова в хвост”, в отличие от повторов диспергированных, которые друг к другу не примыкают. Возникают такие повторы, в частности, из-за “проскальзывания” ферментного комплекса по матрице при копировании ДНК (в результате участок копируется повторно) или из-за ошибок рекомбинации (обмена участками между парными хромосомами).