Болезни печени - [15]

Для определения антигенов различные коммерческие фирмы выпускают тест-системы, которые представляют собой 96-луночные полистироловые планшеты. На дно лунок заранее сорбируют («пришивают») антитела к тому или иному антигену возбудителя, например, к поверхностному антигену вируса гепатита В — HBs-антигену. На первом этапе в каждую лунку добавляют образец, например, сыворотку крови больного в разных разведениях, содержащую пока не определенный вирусный белок (антиген). Если этот белок (антиген) «узнал» свое антитело, то происходит их связывание. Это означает, что сыворотка больного содержит тот антиген, антитела к которому сорбированы на дне планшетки. Для того чтобы увидеть результаты этой реакции, существует следующая стадия, на которой к комплексу «антиген-антитело» добавляют соединение, которое связывается с антителом. Это соединение содержит фермент, например, пероксидазу хрена. При добавлении к нему субстрата происходит расщепление последнего с последующим окрашиванием раствора в желто-коричневый цвет.

На следующей стадии проводят тщательную промывку каждой лунки от непрореагированных компонентов. В тех лунках, где антиген, как в нашем случае, полностью связан с антителом, он уже не может взаимодействовать с добавляемым соединением. Поэтому оно удаляется из лунки при отмывании. По мере разведения сыворотки содержание в ней антител снижается, и они уже не в состоянии полностью связать антиген. В этих лунках соединение, содержащее фермент, связывается с антигеном и остается в лунке после промывания. На следующей стадии добавляют субстрат и смотрят результаты реакции, которые оценивают визуально или с помощью спектрофотометра.

Таким образом, мы выявили, что в образце сыворотки от больного содержится HBs-антиген. Можно также выяснить его количество или титр, определив то последнее разведение сыворотки, где появилось желтое окрашивание. Чем больше степень разведения, тем больше вируса содержится в крови больного.

Подобным образом можно определить наличие антител к тому или иному возбудителю вирусного гепатита. Только в этих случаях используют диагностические тест-системы с «пришитыми» на дно лунок не антителами, а известными антигенами. Достоинствами этого метода являются высокая чувствительность и специфичность, простота постановки реакции, возможность обследования одновременно большого количества пациентов. Среди недостатков метода можно отметить необходимость специального дорогостоящего оборудования и соответствующей квалификации персонала.

Метод полимеразной цепной реакции — это молекулярная клиническая диагностика. Она включает в себя определение белков (антигенов), а также нуклеиновых кислот (или их характерных участков) — возбудителей разных заболеваний. Она начала особенно интенсивно развиваться в начале 1970-х годов после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии (создание моноклональных антител и открытие в 1985 году метода ПЦР). Эти достижения существенным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики.

В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику па принципиально иную высоту — уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биологической среде.

При этом способом ПЦР теоретически может быть обнаружена одна искомая молекула нуклеиновой кислоты среди миллионов других. С точки зрения клинической медицины определение нуклеиновой кислоты равнозначно обнаружению возбудителя в объекте исследования.

Из биологии известно, что нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) обладают свойством к саморепродукции (воспроизводству). Этот принцип и лежит в основе метода ПЦР, когда этот процесс осуществляется искусственно в лабораторных условиях. Для этого из полученного от больного образца ткани (например, в случае подозрения на вирусный гепатит) выделяют сначала нуклеиновую кислоту. Она выполняет роль своеобразной «матрицы», на которой осуществляется синтез. Нуклеиновая кислота имеет свой «отпечаток» — уникальную последовательность нуклеотидов, из которых она состоит. Для каждого возбудителя такая последовательность изучена, составлена своеобразная «карта».

Самый главный элемент в ПЦР — это праймер (короткие участки ДНК, комплементарные (соответствующие) участкам выделенной из образца нуклеиновой кислоты). Праймеры обеспечивают запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси нуклеиновых кислот испытуемого образца, праймера и специальных ферментов (полимераз)) с помощью которых эта реакция невозможна. ПЦР-анализ включает несколько циклов (этапов), в результате которых получаются точные копии распознаваемого участка матричной нуклеиновой кислоты. Эти циклы повторяются 30–50 раз в соответствии с заданной программой. Конечный продукт этой реакции распознается с помощью метода электрофореза в геле.

Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий ДНК или РНК в 1 мл раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую нуклеиновую кислоту, даже если ее концентрация составляет несколько сот копий в 1 мл образца. С этим связано общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем — диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95–98 %.