Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - [28]

Также разработаны флюориметрические, поляриграфические методы и атомно-абсорбционная спектрофотометрия. Они характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Но данные методы в настоящее время в клинической практике широко не используются, поскольку для них требуется специальная аппаратура, высокая квалификация специалиста, и стоимость таких анализов достаточно высока. Данные методы в настоящее время применяются преимущественно в научно-исследовательской практике.

Определение общего белка сыворотки крови биуретовым методом

Принцип метода

Белки сыворотки (плазма) крови, реагируя в щелочной среде с сернокислой медью, образуют соединения, окрашенные в фиолетовый цвет. Эта специфическая биуретовая реакция, характерная для пептидов и белков, применима для фотометрического определения.

В сыворотке здоровых людей содержится 65–78 г/л общего белка, у детей до 6 лет – 5,6–8,5 г/л, у новорожденных – 5,3–8,9 г/л, в моче – 25–70 мг/сутки, в ликворе – 15–45 мг на 100 мл.

Необходимые реактивы

1. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (изотонический раствор): 9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в воде и доводят до метки водой.

2. Натр едкий, 0,2 моль/л: 8 г едкого натра помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, осторожно растворяют в воде и доводят до метки водой.

3. Калия йодид, 30 ммоль/л (раствор йодида калия в 0,2 моль/л растворе едкого натра): 0,5 г йодида калия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором едкого натра до метки и растворяют. Реактив стабилен в течение 2 недель при хранении в посуде из темного стекла.

4. Калий-натрий виннокислый 4-водный (сегнетова соль).

5. Меди сульфат 5-водный.

6. Биуретовый реактив: 4,5 г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 моль/л растворе едкого натра, прибавляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида калия и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль/л раствором едкого натра. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла.

7. Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл 0,5%-ного раствора йодида калия. Раствор стабилен.

8. Калибровочный раствор альбумина (из человеческой сыворотки): 100 г/л раствор альбумина в 154 ммоль/л растворе хлорида натрия.

Ход определения

Опытная проба: к 0,1 мл сыворотки прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива и смешивают, избегая образования пены. Через 30 мин (и не позднее чем через 1 ч) измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостая проба: к 5 мл рабочего биуретового реактива прибавляют 0,1 мл 154 ммоль/л раствора хлорида натрия, далее обрабатывают как опытную пробу.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из калибровочного раствора готовят рабочие растворы так, как указано в таблице 7.

Таблица 7

Приготовление калибровочного раствора

Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего биуретового реактива; через 30–60 мин измеряют на фотометре, как в опыте против холостой пробы. По полученным данным строят калибровочный график. Калибровочная кривая линейна до 100 г/л альбумина.

Нормальные величины: 65–85 г/л (6,5–8,5 г на 100 мл).

Оценка аналитической надежности метода

Метод специфичен, отличается хорошей воспроизводимостью. Воспроизводимость (V) составляет 1,5–3,5%. На правильность метода влияют качество калибровочного материала и корригирование результатов со значением холостой пробы на реактивы и сыворотку. Небольшое число веществ оказывают интерферирующее действие в данной реакции: билирубин при концентрации больше 85 мкмоль/л, триглицериды – больше 11,4 ммоль/л. Для устранения интерференции, вызванной липидемией (присутствием хиломикронов), применяют экстракцию диэтиловым эфиром. Большинство лекарств не вызывают интерференции.

Клинико-диагностическое значение

Результаты определения общего белка сыворотки крови могут быть ложно завышены при наличии липидемии, желтухи, гемолиза. Продолжительное наложение жгута повышает концентрацию всех белков в пробе.

Пробы, полученные выше места внутривенной инфузии, могут дать ошибочно заниженные результаты из-за локальной гемодилюции.

Увеличение содержания белка более 90 г/л имеет место при гипериммуноглобулинемии, поликлональных или моноклональных гаммопатиях.

Снижение содержания белка ниже 60 г/л в сочетании с потерей белка наблюдается при белоктеряющих гастроэнтеропатиях, острых ожогах, нефротическом синдроме.

Понижение содержания белка, вызванное снижением синтеза белка, наблюдается при белковой недостаточности (тяжелая форма), хронических болезнях печени, синдроме мальабсорбции, нарушениях питания, α-γ-глобулинемии.

Спектрофотометрические методы определения общего белка

Данная группа методов основана на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области. Характерные длины волн для поглощения растворов белка – 200–225 нм (обуславливается пептидными связями) и 270–290 нм (обусловлено присутствием ароматических аминокислот, таких как тирозин, триптофан, фенилаланин в молекуле белка).